UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II SCUOLA INTERUNIVERSITARIA CAMPANA DI SPECIALIZZAZIONE ALL’INSEGNAMENTO VIII CICLO TESINA DEL CORSO Chimica analitica Prof. Andini

Destinatari: II anno (ISTITUTO TECNICO) Tempi: 1 lezioni da 55 minuti Collegamenti interdisciplinari: chimica dei materiali;scienze della terra, fisica. Prerequisiti:modulo1(introduzione alla chimica) modulo 2la materia e le sue trasformazioni UNITA’:materia ed energia UNITA’: le trasformazioni fisiche. Obiettivi:descrivere le caratteristiche e le applicazioni della cromatografia. Obiettivi: descrivere le caratteristiche e le applicazioni della cromatografia. Metodologia:lezione frontale, attività di didattica interattiva e partecipata, lavoro di gruppo, esercitazioni di laboratorio. Metodologia: lezione frontale, attività di didattica interattiva e partecipata, lavoro di gruppo, esercitazioni di laboratorio. Strumenti: lavagna, libro di testo, utilizzo di sussidi multimediali Verifica: di tipo orale e corredata da test a risposta aperta e multipla.

CROMATOGRAFIA (dal greco: chroma, colore + graphein, scrivere)

Cromatografia Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo. Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa Le tecniche sono molto utilizzate, essendo particolarmente utili nell’analisi di miscele complesse come sono la maggior parte dei campioni di natura organica

Nascita della cromatografia La cromatografia è nata all’inizio del XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari, inventata dal botanico russo Mikhail Semenovich Tswett. Egli intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; fece un estratto di foglie verdi in etere di petrolio, lo depositò in testa ad una colonna di vetro impaccata con carbonato di calcio ed eluì, (cioè versò in continuo) con solfuro di carbonio: i vari pigmenti si separano in bande colorate, in particolare clorofilla A e B, carotene e xantofilla Tswett chiamò questa tecnica cromatografia dal greco scrittura del colore o, visto il significato del suo cognome in russo, scrittura di Tswett

INTRODUZIONE I metodi di separazione sfruttano le seguenti caratteristiche chimico-fisiche: Carica Dimensioni Solubilità Affinità di legame con altre proteine

Il cromatografo ionico è sostanzialmente un HPLC ed è composto da: Riserva di eluente Pompa tipo HPLC SoppressoreIntegratore Valvola Iniezione Colonna Rivelatore a Conducibilità

Scambio ionico La fase stazionaria è costituita da un polimero inerte contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili, i cui controioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico (IEC) La cromatografia aLa cromatografia a scambio ionico èscambio ionico è impiegata per la impiegata per la separazione di sostanze separazione di sostanze ioniche o ionizzabili ioniche o ionizzabili

CROMATOGRAFIA SCAMBIO IONICO PRINCIPIO Attrazione che si verifica tra cariche di segno opposto La separazione è condotta su colonne impaccate con resine scambiatrici di ioni. Scambiatrici di anioni Scambiatrici di cationi

Scambio anionico A pH maggiore del pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la colonna a scambio anionico. L’eluizione avviene con [Cl-] crescente o abbassando il pH (più difficile da controllare). Scambio cationico A pH minore del pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e lega la colonna a scambio cationico. L’eluizione avviene con [Na+] crescente o alzando il pH. Cromatografia di scambio ionico

In generale le specie che presentano più cariche tenderanno a legarsi più fortemente alla resina È necessario l’impiego di uno ione competitore perché gli analiti vengano rilasciati: ELUENTE

Visualizzazione della separazione Ponendo all’uscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto nell’eluato (cioè la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo si può ottenere un cromatogramma La posizione dei picchi sull’asse dei tempi, o tempo di ritenzione, serve per identificare i componenti del campione L’area sottesa dai picchi è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo.

Tempo di ritenzione Il tempo di ritenzione t R è il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector. Un tipico cromatogramma per una miscela a due componenti ha due situazioni diverse: il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, t M il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, t M il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo t R > t M il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo t R > t M

Cromatografia di scambio ionico

Le resine a scambio ionico sono costituite da un reticolo irregolare tridimensionale di catene di natura organica unite tra loro da legami incrociati. Su questa matrice sono fissati dei raggruppamenti ionici (quali –SO3-,COO-, -NR3+) in grado di interagire con uno ione metallico o per semplice scambio ionico o mediante formazione di legami di coordinazione (resine complessanti o chelanti). Lo scambiatore si dice cationico quando contiene delle cariche negative e i cationi sono attratti elettrostaticamente da questi siti di carica opposta. Lo scambiatore si dice anionico quando contiene dei gruppi carichi positivamente in grado cioè di legare degli ioni di carica negativa. Solitamente uno scheletro polistirenico è ottenuto per copolimerizzazione dello stirene con il divinilbenzene. Il contenuto di divinilbenzene può variare dall’ 1 al 16% e determina il grado di reticolazione (cross-linking). Gli anelli benzenici possono venire modificati per produrre una resina a scambio cationico contente gruppi solfonato (-SO3-) oppure una resina anionica contenente gruppi ammonici (-NR3+). Se al posto dello stirene si usa acido metacrilico si ottiene una resina con gruppi attivi carbossilici e scheletro acrilico divinilbenzenico (-COO-).

CROMATOGRAFIA SCAMBIO IONICO La comune definizione delle resine ioniche è fatta sulla base della acidità del loro gruppo attivo. CationicoAnionico Forte-SO 3 - H + -N + (CH 3 ) 3 OH - Debole-COO - H + -N + H 3 OH - Ampio intervallo di pH di utilizzo Ridotto intervallo di pH di utilizzo

Il grado di reticolazione nelle resine a scambio ionico è variabile ed è scelto in funzione delle caratteristiche che deve presentare lo scambiatore. Resine con alto gradodi reticolazione sono rigide e poco porose,lente nel raggiungere l’equilibrio, anche se la selettività e la capacità sono maggiori rispetto alle resine con basso grado di reticolazione (dette anche macroporose) sono più veloci ad equilibrarsi, ma che si rigonfiano d’acqua. L’affinità maggiore per la fase resina è per ioni: 1) a carica elevata, 2)a piccolo raggio di idratazione, 3) molto polarizzabili (polarizzabilità è capacità della nuvola elettronica di uno ione a venire deformata da cariche vicine e a formare un dipolo).

Come sono fatte le resine scambiatrici? Sono costituite da gruppi carichi legati covalentemente ad una matrice di supporto MATRICI polimeri di stirene chimicamente: CM-cellulosa DEAE-cellulosa derivati del destrano e dell’agarosio (Sephadex e Sepharose) GRUPPI IONICI FUNZIONALI gruppo solfonato ammine quaternarie gruppo carbossilico dietilammonio Scambiatori fortiScambiatori deboli

S C A M B I A T O R I P I U’ C O M U N I RESINASUPPORTOGRUPPO FUNZIONALE TIPO DEAE Sepharose (Pharmacia) DEAE Bio-Gel A (Bio-Rad) Agarosio CH2CH2N+H(CH2 CH3) 2 dietilaminoetil (DEAE) Scambio anionico (debole) QAE Sephadex C50 (Pharmacia) Destrano Dietil-(2- idrossipropil) aminoetil (un ammina quaternaria) Scambio anionico (forte) CM Sepharose (Pharmacia) Agarosio -CH2COO- Carbossimetil Scambio cationico (debole) SP Sephadex C50 (Pharmacia) Agarosio -(CH2) 3SO3- Sulfopropil Scambio cationico (forte

Carbossimetilcellulosa AGAROSIO

LE COLONNE Sono il cuore dello strumento. La separazione avviene per una serie di equilibri di scambio tra fase stazionaria e fase mobile (eluente). Gli ioni con carica netta più elevata (al pH dell’eluente) vengono trattenuti più fortemente A parità di carica vi è un ordine di selettività che dipende dal tipo di fase stazionaria (dipende dalle costanti di scambio). Forti Deboli

ELUENTE La fase eluente deve contenere elettroliti forti, composti ionici completamente dissociati, in grado di competere con gli analiti nello scambio con la resina. Gli analiti vengono eluiti più velocemente quanto più è alta la concentrazione di competitori. Se rimane costante durante tuttal’analisi -> Eluizione Isocratica Se cambia di composizione durante l’analisi -> Gradiente di Eluizione Forza Ionica pH Concentrazione dei costituenti

RIVELATORE Dato che si determinano ioni, il rivelatore universalmente utilizzato è costituito da una piccola cella conduttimetrica. Applicando una piccola ddp tra i due elettrodi, fluisce una corrente proporzionale alla conducibilità dell’eluente + analita. Problema: poiché i rivelatori a conducibilità rispondono a tutti gli ioni e l’eluente è costituito da una soluzione elettrolitica concentrata, il suo segnale coprirebbe quello degli analiti. Come è possibile ovviare al problema?

SOPPRESSIONE La conducibilità dell’eluente viene eliminata mediante un Soppressore L’unità di soppressione può essere costituita da: Cartucce usa e getta Micromembrana rigenerata controcorrente Micromembrana rigenerata elettroliticamente Il soppressore è uno scambiatore di ioni di segno opposto rispetto agli analiti ed ha lo scopo di diminuire il segnale di fondo dato dagli ioni contenuti nell’eluente.

Cromatografia di scambio ionico

VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI Proteine allo stesso Ph e concentrazioni di sali della colonna. Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.