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2 come separare questi oggetti 1 2 3 9 10 11 12 6 4 8 5 7 4 5 8 lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone cotone lana pietra Forma Grandezza Densità forma Densità grandezza Diversa grandezza Differente sedimentazione Differente velocità di rotolamento 4 6 7 8 5 1 3 4 6 7 8 9 10 11 12 2 5 Juang RH (2004) BCbasics

3 Basic Principles of Protein Purification Ammonium sulfate fractionation Cell Organelle Homogenization Macromolecule Nucleic acid Carbohydrate (Lipid) SizeChargePolarityAffinity Small molecule Cell Debris Protein Amino acid, Sugar, Nucleotides, etc Gel filtration, SDS-PAGE, Ultrafiltration Ion exchange, Chromatofocusing, Disc-PAGE, Isoelectric focusing Reverse phase chromatography, HIC, Salting-out Affinity chromatography, Hydroxyapatite Juang RH (2004) BCbasics

4 Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico RIVELATORE colonna pompa Collettore di frazioni Soluzione di eluizione

5 Scambio ionico: separazione in funzione della carica

6 Importanza del pI -A pH > pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e si lega a una resina a scambio anionico ( SCAMBIO ANIONICO ). -A pH < pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e si lega a una resina a scambio cationico ( SCAMBIO CATIONICO ).

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10 Cromatografia di scambio ionico VANTAGGI –Per grandi volumi, –Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), –Matrice molto robusta, –Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI –Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. –Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.

11 GEL FILTRAZIONE

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14 Cromatografia di affinità Resina Braccio spaziatore Ligando

15 Cromatografia di affinità Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna Le altre proteine vengono “lavate” via. La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.

16 Cromatografia di affinità VANTAGGI Alta affinità, costanti di dissociazione nell’ordine del mM, nM o anche pM. Legame tutto o nulla: Possibili molte variazioni (affinity tags) SVANTAGGI L’ingombro sterico spesso abbassa la capacità Il braccio spaziatore può avere influenza sul legame L’eluizione può richiedere un eluente specifico