MOLECOLE CHE POSSIEDONO GRUPPI IONIZZABILI ELETTROFORESI Metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un campo elettrico MOLECOLE CHE POSSIEDONO GRUPPI IONIZZABILI nucleotidi Acidi nucleici Aminoacidi proteine

Metodi FRONTALI - in soluzione libera ELETTROFORESI Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico. Tecnica soprattutto ANALITICA ma anche PREPARATIVA. E’ un mezzo di separazione molto potente, fra i piu’ usati in biochimica Metodi FRONTALI - in soluzione libera Metodi ZONALI – attraverso un mezzo poroso Gel (agarosio – amido) Carta Acetato di Cellulosa

FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITA’ DI MIGRAZIONE Natura del supporto Campo elettrico applicato Caratteristiche della particella: Massa Carica Dimensioni forma m mobilità elettroforetica velocità di migrazione Campo elettrico applicato m =

assorbimento – ritenzione di molecole da parte del supporto NATURA DEL SUPPORTO assorbimento – ritenzione di molecole da parte del supporto Elettroendosmosi – per la presenza di gruppi carichi sulla superficie del mezzo di supporto Carta – COOH Agarosio – SO4- pareti di vetro – Si-OH Filtrazione molecolare – effetto setaccio

CAMPO ELETTRICO APPLICATO Voltaggio – Corrente - Resistenza La differenza di potenziale tra gli elettrodi genera: E = V / d E = gradiente di potenziale V = voltaggio applicato d = distanza fra gli elettrodi Intensità di corrente = Voltaggio applicato / Resistenza

INFLUENZA DEL TAMPONE ha la funzione di mantenere le molecole del campione in uno stato di ionizzazione COMPOSIZIONE: non deve legarsi ai composti da separare CONCENTRAZIONE: da 0.05 a 0.10 M pH : determina, influenza, stabilizza la velocità di migrazione RISULTATI RIPRODUCIBILI VOLTAGGIO O AMPERAGGIO COSTANTI

A parità di condizioni elettroforetiche: CARATTERISTICHE DELLA MOLECOLE SOTTOPOSTE A ELETTROFORESI Carica – dimensioni - massa A parità di condizioni elettroforetiche: Campo Elettrico applicato Supporto in cui avviene l’elettroforesi Le molecole si separano sulla base del rapporto Carica/Massa

Un sistema per elettroforesi è costituito da Alimentatore Camera (Cella) elettroforetica Orizzontale Verticale Supporto Gel (agarosio o poliacrilamide) Solido poroso (carta da filtro o acetato di cellulosa) Sulla base alla composizione del mezzo in cui avviene l’elettroforesi : Elettroforesi in condizioni native – denaturanti – riducenti Isoelettrofocalizzazione (IEF) Elettroforesi bidimensionale Elettroforesi su gradiente

ELETTROFORESI SU SUPPORTO su carta su gel

CELLA ELETTROFORETICA CON GEL VERTICALE

GEL DI AGAROSIO: usato per separare frammenti di DNA grandi (da 500 bp a 20-40* Kbp) GEL DI ACRILAMMIDE: usato per separare frammenti di DNA piccoli (da 1 nucleotide a ca 2 Kbp) I FRAMMENTI DI DNA SI MUOVONO VERSO IL POLO POSITIVO AD UNA VELOCITA’ INVERSAMENTE PROPORZIONALE AL LOGARITMO DELLA LORO LUNGHEZZA (rapporto CARICA / MASSA è COSTANTE)

Nei gel di agarosio i pori sono formati da molecole di polisaccaridi che partecipano alla formazione di strutture a doppia elica Questi “pori” non hanno una struttura regolare e la loro dimensione si controlla variando la concentrazione di agarosio Piu’ agarosio si usa più grande sarà il numero delle eliche formate per unita’ di spazio e piu’ piccola sara’ la dimensione media dei pori

GEL DI AGAROSIO

ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO Separazione ed analisi di campioni contenenti DNA o RNA Si scioglie l’agarosio in polvere nel tampone in seguito ad EBOLLIZIONE della sospensione Dopo raffreddamento fino alla temperatura di ca 55-60°C la soluzione si versa in un vassosio dove gelificherà Un pettine genera gli spazi dove in seguito si depositano i campioni Il gel viene immerso completamente nel tampone Migrazione verso il polo positivo (anodo) separazione in base alla MASSA dei frammenti di DNA/RNA poiché qualunque DNA/RNA si consideri il rapporto CARICA / UNITA’ DI MASSA è costante

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

GEL DI AGAROSIO (C) (A) (B) A) GEL POSTO SUL TRANSILLUMINATORE AD UV SPENTO B) GEL POSTO SU TRANSILLUMONATORE AD UV ACCESO C) IMMAGINE DIGITALIZZATA A TONI DI GRIGIO DEL GEL IN B)

Fattori che influenzano la migrazione del DNA in gel di agarosio Peso molecolare (peso dei DNAdi DNA in Daltons) Concentrazione di agarosio Conformazione DNA (lineare, circolare (superavvolto o rilassato) Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

Tamponi di elettroforesi

Soluzioni di caricamento

Soluzioni per il caricamento di DNA su gel Aumentano la densità del campione Colorano il campione Rendono visibile la corsa elettroforetica

La velocita’ di migrazione (o mobilità elettroforetica) dipende: 1) dalle dimensioni dei frammenti 2) dalla percentuale dell’agarosio nel gel 3) dal voltaggio applicato. Frammenti lineari piccoli migrano più velocemente rispetto a quelli grandi A parità di peso molecolare, il DNA circolare migra più velocemente di un DNA lineare se assume una conformazione detta superavvolta (super coiled DNA), più lentamente se la molecola circolare contiene uno o più rotture sui filamenti di DNA (forma rilassata o open-circular)

DNA circolare con superavvolgimento = 0 DNA superavvolto negativamente

Migrazione del DNA nel gel Esiste una relazione inversa tra la mobilità elettroforetica (Distanza migrata rispetto al pozzetto, in cm) e la lunghezza del frammento di DNA (in daltons; log10 della lunghezza) Questa relazione è lineare per buona parte della distanza migrata (vedi curve) anche variando la concentrazione di agarosio (%ali indicate) Ciò consente di creare delle “rette di regressione” facendo migrare nel gel DNA a lunghezza nota e confrontando la migrazione dei marcatori con la migrazione di DNA di lunghezza ignota, del quale si può in questo modo stimare la lunghezza in paia di basi N.B.: sarebbe più corretto parlare di log10 del PESO MOLECOLARE di un DNA ma il peso molecolare di fatto equivale alla sua lunghezza. Es.: un DNA lineare lungo 1000 paia di basi ha un peso molecolare di 1000 x 660 = 660000 (660 è il peso medio di una coppia di basi. Il calcolo si fa ipotizzando DNA a composizione media di A, T, C, G in proporzioni uguali)

Come si rivelano nel gel gli acidi nucleici? Colorazione con ETIDIO BROMURO (EtBr, colorante fluorescente) o con coloranti alternativi che hanno la stessa funzione ma non sono mutageni/tossici Il EtBr contiene un gruppo planare che si intercala tra le coppie di basi del DNA. il colorante viene quindi visualizzato irradiando il gel con raggi U.V. (ad esempio con un transilluminatore); in questo modo si visualizzano i frammenti di DNA a cui il ETBr si è associato Una volta i gel si fotografavano su pellicola, Polaroid o simile. Oggi si utilizzano apparecchi dotati di sensori CMOS o CCD (una tecnologia molto simile a quella delle macchine fotografiche digitali)

Come si rivelano nel gel gli acidi nucleici? I gel di agarosio correntemente vengono fotografati digitalizzando le immagini sia per l’analisi dei risultati che per ulteriori utilizzi. la sensibilità del rilevamento consente di visualizzare singole bande di DNA contenenti un minimo di 20-50* nanogrammi. Come detto prima esistono in commercio molti coloranti non pericolosi e privi di rischi che si possono utilizzare in alternativa al EtBr Nonostante le assicurazioni delle ditte questi coloranti spesso non hanno la stessa sensibilità di rilevamento del EtBr. QUINDI: se fate elettroforesi di DNA con coloranti alternativi al EtBr, usate più DNA: almeno 100 nanogrammi per singola banda di DNA da visualizzare

Visualizzazione del DNA

Il Bromuro di Etidio assorbe gli UV con un picco a 285 nm e restituisce fluorescenza nell’arancio con un picco a 605 nm (solo se è intercalato al DNA)

Marcatori di peso molecolare  HindIII I numeri indicano la lunghezza dei frammenti in paia di basi

Fotodocumentazione IMAG0887.jpg

Mappe di restrizione del DNA Tagliando un DNA con uno o più enzimi di restrizione e facendo poi migrare su gel i prodotti delle digestioni si ottengono “profili elettroforetici” che consentono di stabilire la posizione dei siti di taglio degli enzimi usati sul DNA, cioè consentono di disegnare una mappa del DNA sulla quale posizionare i siti di taglio in modo ordinato La procedura è visualizzata nelle diapositive seguenti con una piccola animazione

1 2 3 4 1 10 kb

1 2 3 4 1 10 kb Eco R1 3 kb 7 kb 2

1 2 3 4 1 10 kb 2 Eco R1 3 kb 7 kb PstI 4 kb 6 kb 3

1 2 3 4 1 10 kb 2 Eco R1 3 kb 7 kb 3 PstI 4 kb 6 kb PstI 6 kb 4 kb 6 kb PstI Eco R1 3 kb 1 kb 4

PFGE: Pulsed Field Gel Electrophoresis - Elettroforesi a Campi Pulsati E’ un particolare tipo di elettroforesi in gel di agarosio: il campo elettrico è a IMPULSI DI CORRENTE ed è orientato, spesso a 120°, tra un impulso e il seguente Consente di separare DNA MOLTO grandi, anche interi cromosomi Nella figura sono visualizzati i cromosomi di un isolato di Plasmodium falciparum (clone 3D7) e della linea di riferimento Palo Alto. I marcatori di peso molecolare sono ricavati dalla migrazione di un ceppo di lievito (Hansenula wingei, BioRad). In ogni corsia sono stati applicati circa 2 x 107 parassiti. Il DNA è stato separato su un apparato CHEF (BioRad) usando un gel allo 0.8% di agarosio in 0.5x TBE a 18°C. Impulsi da 90 sec a 300 sec per 24 hr a 95 volts seguiti da impulsi da 300 sec a 720 sec per 24 hr a 85 volts.

I profili PFGE possono servire a stabilire relazioni tra batteri che esibiscono pattern simili di resistenza multipla ad antibiotici e quindi a meglio inquadare le patologie dovute ai batteri. Nella figura profili PFGE di S.aureus multiresistenti alla meticillina ottenuti con l’enzima SmaI. I ceppi B e C sono identici. Profili PFGE di digestioni SmaI di S. pneumoniae. A, marcatori di peso molecolare; B e C ceppi penicillina sensibile e resistente, rispettivamente, isolati dallo stesso paziente. In sostanza, la tipizzazione molecolare con PFGE di isolati batterici rappresenta uno strumento utile ed efficace per contribuire in campo epidemiologico e clinico alla diagnosi, terapia e controllo delle infezioni da microrganismi