Fase diretta-1 Tecniche di separazione e tipi di fasi in cromatografia liquida la silice Fase stazionaria: la silice è di gran lunga la più utilizzata. E’ un materiale altamente polare per la presenza di gruppi silanolo SiOH Forma isolata o libera: alta capacità di adsorbimento Forma legate con formazione di legame idrogeno o silossani: bassa capacità di adsorbimento Una stabilizzazione dell’attività della superficie della silice può essere ottenuta controllando il contenuto di acqua della fase mobile (fase mobile isoidrica). La silice presenta una serie di svantaggi quali:  Stabilità in un intervallo limitato di pH  Adsorbimento irreversibile di analiti fortemente polari  Necessità di un controllo rigoroso del contenuto di acqua della fase mobile per ottenere risultati riproducibili  Lenta riequilibriazione al cambiamento della composizione della fase mobile Tali svantaggi sono in parte superati utilizzando silice modificata con gruppi cianopropilici, amminopropilici, diolici

Caratteristiche della silice La particella di silice ha una struttura microporosa  I pori hanno un diametro variabile tra 60 e 1000 A.  Dato che circa il 98%della superficie attiva della silice è all’interno dei pori, le molecole di soluto devono entrare nei pori per essere separate. Porosità La superficie di una particella di silice è inversamente proporzionale al diametro dei pori.  Le silici con pori piccoli ( A) tipicamente usate per analiti con p.m. <2000 Da hanno aree superficiali di m 2 /g. Area superficiale Viene in genere utilizzata silice costituita da particelle sferiche regolari Diametri 3-7  m Fase diretta-2

Fase mobile Solventi non polari : esano + modificanti polari: CH 2 Cl 2, metilt-butiletere, CHCl 3, AcOEt Fase diretta-3 Il meccanismo di ritenzione è la sostituzione. La ritenzione è basata sulla competizione tra le molecole del soluto e quelle della fase mobile per i siti attivi della fase stazionaria A basse concentrazioni i modificanti polari lasciano la fase mobile e tendono ad accumularsi sulla superficie della fase stazionaria. Le molecole di soluto che formano legame ad idrogeno con il modificante polare hanno tempi di ritenzione maggiori. A concentrazioni elevate la superficie diventa satura e la concentrazione relativa del modificante nella fase mobile aumenta, le interazioni ad idrogeno nella fase mobile aumentano e i tempi di ritenzione si riducono. Effetto di modificanti con proprietà di legame ad idrogeno

Fase inversa-1 Fase stazionaria silicemodificata Fase stazionaria : silice modificata con diversi tipi di gruppi funzionali Fase mobile: acqua Fase mobile: acqua o tamponi acquosi con modificanti MeOH, CH 3 CN, THF polari miscibili in acqua MeOH, CH 3 CN, THF La ritenzione è basata sulla ripartizione dell’analita tra fase mobile e stazionaria. Analiti più polari si ripartiscono più favorevolmente nella fase mobile e sono eluiti prima. Analiti meno polari hanno maggiore affinità per la fase stazionaria e sono più ritenuti. Per quest’ultimi in realtà il principale meccanismo di ritenzione è idrofobico o solvofobico. E’ la repulsione per la fase mobile a controllare la ritenzione piuttosto che l’attrazione dell’analita per la fase stazionaria. Fasi mobili non polari Fasi mobili non polari (contenenti maggiori proporzioni di solvente organico) Danno tempi di ritenzione minori  fasi mobili forti Fasi mobili polari Fasi mobili polari (contenenti maggiori proporzioni di acqua ) Danno tempi di ritenzione maggiori  fasi mobili deboli Tecniche di separazione e tipi di fasi in cromatografia liquida

Fase inversa-2 Schema per la sintesi di fasi stazionarie monomeriche basate su gel di silice. La variabile n rappresenta il numero di gruppi silano che reagiscono per formare la fase stazionaria legata. Se si usano silani di- o tri- funzionali, anziché monofunzionali anche i gruppi di silanolo adiacenti reagiscono. Si ottiene una superficie di silano reticolato con maggiore stabilità e selettività diversa rispetto alla fase stazionaria di tipo monomerico

Disattivazione dei silanoli superficiali  I silanoli liberi possono dar luogo ad interazioni secondarie polari.  Per ottenere fasi inverse con un comportamento unicamente idrofobico i gruppi silanolici residui vengono disattivati con un processo detto di “endcapping”.  Di solito si usano gruppi apolari come il trimetilclorosilano che rende la superficie della silice maggiormente idrofobica. Silanoli superficiali liberi Fase inversa-3 A causa dell’ingombro sterico dei gruppi legati solo il 50-60% dei silanoli superficiali reagisce. Nel caso della C-18 solo il 10-20% dell’area superficiale della silice espressa come % C o grado di ricopertura in  mol/m 2 può essere legata.

Fasi completamente idrofobiche Fasi idrofobiche con un gruppo polare Prive di silanoli accessibili collassano a basse concentrazioni di solvente organico. Per prevenire il collassamento della fase idrofobica ed aumentare le interazioni dell’ analita con la fase stazionaria in fasi mobili prevalentemente acquose vengono incorporati gruppi polari come eteri, ossidrili, carbammati o ammidi nella catena idrofobica vicino alla superficie della silice. Fase inversa-4 Le fasi C-18 molto idrofobiche e prive di funzionalità polari sono solvatate solo in presenza di un 5-10% di modificante organico.Solo in queste condizioni la fase è distesa nella fase mobile consentendo l’interazione degli analiti. Fase mobile ricca di solvente organico Quando la concentrazione di solvente organico nella fase mobile scende queste fasi collassano e i k’ diminuiscono costantemente. Le fasi collassate sono difficili da riequilibrare. Fase mobile prevalente- mente acquosa

Ruolo dei silanoli residui I silanoli residui in grado di interagire con gli analiti conferiscono alla fase stazionaria una maggiore selettività polare cioè una migliore capacità di differenziare molecole la cui parte idrofobica è simile e le uniche differenze consistono nella quantità e disposizione dei gruppi polari. Endcapping polare E’ possibile utilizzare un silano con un gruppo polare per realizzare l’end-capping Fase inversa-5

Fasi stazionarie alchiliche Le colonne C-18 sono generalmente più ritentive delle C-8 Fase inversa-6 Campione 1.Tiourea 2.Fenolo 3.Anilina 4.o-Toluidina 5.m-Toluidina 6.p-Toluidina 7.N,N-Dimetilanilina 8.Etilbenzoato 9.Toluene 10.Nitrobenzene

Fasi stazionarie feniliche La selettività delle fasi feniliche si basa soprattutto sulle interazioni  che si instaurano con gli anelli benzenici La lunghezza della catena alchilica che lega il fenile determina l’idrofobicità complessiva della fase stazionaria Rispetto alle fasi alchiliche hanno caratteristiche di selettività complementari ed idrofobicità inferiori a parità di atomi di carbonio Fase inversa-7

Le fasi stazionarie più versatili Fase inversa-8

Tecniche di separazione e tipi di fasi in cromatografia liquida Scambio ionico-1 Fase stazionaria Fase stazionaria : silice legata ad un gruppo funzionale avente una carica positiva (scambiatori anionici) o negativa (scambiatori cationici). Fase mobile: Fase mobile: tamponi a diverso pH o forza ionica con modificanti organici miscibili MeOH, CH 3 CN, THF.  La matrice silicea è preferita per l’analisi in scambio ionico in HPLC perché permette l’impiego di solventi utili per rigenerare la colonna, sopprimere interazioni idrofobiche e modulare l’eluizione.  L’efficienza di queste colonne è superiore rispetto a quella degli scambiatori a matrice polimerica.  Non è possibile utilizzare pH estremi (soprattutto basici).

Scambio ionico-2 pH

Eluizione in gradiente di pH Scambio ionico-3

Forza ionica Eluizione in gradiente salino Scambio ionico-4

Effetto solvente organico nella fase mobile Assenza solvente organico nella fase mobile Con aggiunta solvente organico nella fase mobile Scambio ionico-5

Riassumendo:

Accoppiamento ionico-1 Tecniche di separazione e tipi di fasi in cromatografia liquida  Si utilizza quando è necessario ritardare l’eluizione di composti ionizzati  Si aggiungono alla fase mobile additivi in grado di creare una “coppia ionica” (ion pair) con gli analiti. Un agente di coppia ionica è un composto contenente un gruppo ionizzato con carica opposta a quella presente sull’analita e una parte idrofobica in grado di aumentare l’interazione con la fase stazionaria L’agente di coppia ionica crea una superficie carica sulla fase stazionaria e forma con gli analiti una specie complessivamente neutra con aumentata affinità per la fase stazionaria Tetrabutilammonio

Eluizione di una miscela contenente composti amminici in presenza di un agente di coppia ionica Accoppiamento ionico-2 Ritenzione di composti carichi e neutri per coppia ionica con decil solfato All’aumentare della concentrazione dell’agente di coppia ionica  Le specie cariche positivamente per protonazione sono più ritenute  I composti anionici eluiscono prima.  I composti neutri sono debolmente influenzati

Tecniche di separazione e tipi di fasi in cromatografia liquida Esclusione molecolare Fase stazionaria: Fase stazionaria: copolimeri stirene-divinilbenzene, poliidrossimetaacrilati, polisaccaridi Limiti di esclusione: 2.5 – KDa Fase mobile: Fase mobile: GPC  THF e CHCl 3, DMF (per polimeri polari come melamine e resine fenoliche) GFC  acqua, tamponi acquosi

GPC: miscela standard di polimetilmetaacrilato Column :Shodex GPC KF-806Lx2 Eluent :THF Flow rate :1.0mL/min. Detector :Shodex RI Column temp. :40 °C

GFC: Separazione di proteine

Scelta delle condizioni di analisi Il diametro della colonna-1 La velocità lineare di flusso deve rimanere costante per poter ottenere la stessa separazione passando ad un diverso diametro interno. Occorre adeguare il flusso, il volume di iniezione e la massa iniettata secondo il rapporto dei quadrati dei diametri interni, purchè non cambi la lunghezza della colonna. Classificazione delle colonne in base al diametro

Effetto del diametro interno sulla sensibilità dell’analisi Il diametro della colonna-2 Colonne di piccolo diametro sono fino a 4-6 volte più sensibili delle colonne di diametro standard 4-5 mm Riducendo il diametro interno e mantenendo invariati L e d p, la dispersione del picco diminuisce e la sensibilità aumenta

La lunghezza della colonna 15 cm 25 cm Aumentando la lunghezza della colonna Aumenta il numero di piatti proporzionalmente all’altezza del piatto teorico Aumenta la contropressione Aumenta t 0 : tempi di analisi maggiori Aumenta il tempo di riequilibrazione Aumenta il volume del picco 50 x 4.6 mm 4.9 min 30 x 4.6 mm 3.4 min 20 x 4.0 mm 2.4 min R s =1.4 R s =1.8

La dimensione delle particelle Diminuendo la dimensione delle particelle: Aumenta l’efficienza della separazione perché aumenta la densità di impaccamento e diminuisce l’altezza del piatto teorico Aumenta la contropressione Diminuisce il volume del picco 3  m 150x4.6 mm 5  m 150x 4.6 mm 4 mL/min :1800 psi 1 mL/min :1250 psi R s =1.4 R s =2.1

Riduzione della lunghezza della colonna e del diametro delle particelle in LC –MS E’ conveniente combinare la riduzione di lunghezza con una diminuzione del diametro particellare. Ciò permette di lavorare a flussi alti riducendo il tempo di analisi (soprattutto in isocratica) senza perdere efficienza e mantenendo gli stessi k’ 3  m 150x4.6 mm 1 mL/min 3  m 100x4.6 mm 1 mL/min 3  m 100x4.6 mm 2 mL/min

La fase mobile Eluenti comunemente utilizzati in cromatografia liquida Il termine solvente si riferisce al liquido puro (CH 3 CN, CH 2 Cl 2 ) che viene mescolato ad altri solventi e tamponi per formare la fase mobile

Scelta della fase mobile in LC/MS

Selettività fase inversa-fase diretta Ottimizzazione della fase mobile: metodo basato sul triangolo di Snyder I solventi più vicini ai vertici hanno proprietà molto diverse fra loro e forniscono condizioni eluenti a selettività alternativa. In fase diretta la separazione fra solventi alternativi è maggiore rispetto alla fase inversa dove il requisito di miscibilità con l’acqua limita la scelta dei solventi Le proprietà che contribuiscono maggiormente alla polarità di un solvente e ne determinano la selettività sono: Accettazione protica ( x e )Accettazione protica ( x e ) Donazione protica (x d )Donazione protica (x d ) Interazione dipolare ( x n )Interazione dipolare ( x n ) Le caratteristiche dei solventi di maggiore interesse in LC sono :  La forza  La selettività Definizione dei gruppi di selettività sulla base di questi tre parametri Ciascun gruppo comprende solventi con selettività simile  la scelta di un secondo solvente appartenente alla stessa classe di selettività non produce variazioni sostanziali nella separazione cromatografica

Metodo empirico per l’ottimizzazione della fase mobile in un massimo di sette corse cromatografiche-1 Stadio 1: Stadio 1: determinare una condizione cromatografica che soddisfi i requisiti stabiliti (es tempo di analisi ). I picchi 1 e 2 non sono adeguatamente risolti, ma il resto del cromatogramma è soddisfacente Stadio 2: Stadio 2: stabilire condizioni isoeluotropiche cioè condizioni che diano gli stessi tempi di ritenzione usando solventi con caratteristiche di selettività differenti dai precedenti. Acetonitrile/Acqua Metanolo/Acqua Tetraidrofurano/Acqua Nomogramma per la valutazione di fasi mobile isoeluotropiche in cromatografia liquida in fase inversa. MeOH/H 2 O 60:40

A B A/B 50/50 A/C 50/50 B/C 50/50 A/B/C 33/33/33 C Stadio 3: Stadio 3: realizzare altri 4 cromatogrammi nelle condizioni corrispondenti agli altri punti indicati nel triangolo. La risoluzione dei picchi iniziali è migliore che in A, ma quella dei picchi finali è peggiore. CH 3 CN/H 2 O 50:50 La risoluzione dei picchi è peggiore che in A THF/H 2 O 37:63 Metodo empirico per l’ottimizzazione della fase mobile in un massimo di sette corse cromatografiche-2

Stadio 4: Stadio 4: con i 7 cromatogrammi realizzati diventa facile scegliere quello in cui si è realizzata la migliore separazione ovvero effettuare una ulteriore corsa per modulare in maniera fine la separazione. CH 3 CN/THF/H 2 O 14:19:67 Se dopo aver realizzato tutta la procedura nessuna delle condizioni fornisce una separazione soddisfacente questo può indicare che la scelta della tecnica cromatografica (fase diretta, inversa ) non è corretta. Metodo empirico per l’ottimizzazione della fase mobile in un massimo di sette corse cromatografiche-3 Buona risoluzione su tutto il cromatogramma

Eluizione isocratica Fase diretta Metodi di eluizione Fase inversa La variazione della selettività del solvente varia l’ordine di eluizione

Eluizione in gradiente Tipici profili di gradiente Aumentando la pendenza del gradiente: La risoluzione diminuisce I picchi sono più stretti ed alti: aumenta la sensibilità Cambia la selettività Colonna:Luna 5  m C18 150x4.6 mm Fase mobile: A) acqua, B)acetonitrile Gradiente: da 20 %B a 80%B Flusso: 1mL/min 1%/min 3%/min 2%/min Effetto della pendenza del gradiente sulla risoluzione

1. Eseguire una corsa con un gradiente lineare Metodo per la scelta del profilo del gradiente 2. Sulla base della risoluzione dei picchi si può scegliere il profilo di gradiente più adatto 3. E quindi variarne la pendenza per ottimizzare la risoluzione

Fig p.11 e 12 la fase mobile chemtek Il pH della fase mobile influisce sullo stato ionico e sulla solvatazione del soluto. Questo influenza la ritenzione degli analiti Effetto del pH della fase mobile sulla ritenzione Effetto del pH sulla ritenzione di acidi

Effetto della velocità del flusso-1 Equazione di Van Deemter per la cromatografia liquida HETP=A+C  n Il termine A è in genere piccolo; Il termine B/  è trascurato perché la diffusione longitudinale nei liquidi dà un contributo molto minore che nei gas. L’esponente n varia tra 0.3 e 0.6. Quindi all’aumentare della velocità del flusso HETP aumenta asintoticamente In pratica questo significa che in LC possiamo aumentare la velocità del flusso senza avere una perdita significativa nell’efficienza della colonna

Aumento del flusso Utilizzando lo stesso tipo di gradiente, ma aumentando la velocità del flusso si ha: Notevole diminuzione del tempo di analisi Risoluzione paragonabile Effetto della velocità del flusso-2

Tabella fasi stazionarie