Prunus persica… I problemi legati alla propagazione in vitro del pesco, spesso, dipendono dall’iperidricità dei tessuti. Il terreno viene trasferito da una bottiglia all’altra grazie alla pressione creata da una pompa ad aria, l’aria spinta nella bottiglia passa attraverso un filtro sterile. Con questo metodo le piante sono in contatto con il terreno per un breve periodo, sufficiente a stimolare lo sviluppo e la crescita. La rimozione del terreno previene l’accumulo di etilene. In questo caso si utilizza il sistema ad immersione tempoanea. Due bottiglie di vetro sono connesse da un tubo di silicone, una bottiglia contiene gli espianti su un supporto di biglie di vetro che garantiscono l’isolamento dal terreno di coltura durante il periodo di non immersione, la seconda bottiglia contiene il terreno di coltura.

Prunus dulcis… Nella micropropagazione del mandorlo il problema principale è la necrosi degli apici. In questo caso la modificazione dei protocolli e, in particolare, del tempo di subcoltura è stato fondamentale. Infatti un periodo lungo (> 20 giorni) causava la necrosi degli apici. Subcolture di giorniSubcolture di giorni

SISTEMI DI RIGENERAZIONE L’accrescimento dell’apice meristematico interviene quando il meristema apicale di un’ estremità del germoglio viene fatto radicare per la produzione di una plantula. Tale procedura viene impiegata principalmente per ottenere piante esenti da virus, nelle quali solo il meristema apicale (0,5mm) è rimosso assieme a poche foglie sottostanti. I punti laterali di crescita sui nodi dell’espianto, sotto il meristema apicale, sono stimolati a crescere, mentre viene inibito il meristema apicale stesso. La crescita dei germogli ascellari provoca un processo di rapida moltiplicazione, nel quale il numero di piante potenziali, ad ogni ripetizione, aumenta esponenzialmente. Induzione diretta di germogli avventizi su radici, foglie, bulbi ed altri organi. Questi possono svilupparsi sia direttamente dall’espianto sia indirettamente da masse di tessuto calloso indifferenziato. L’organogenesi si riferisce alla produzione sia di germogli avventizi che di radici da cellule entro masse callose. Queste masse cellulari possono sviluppare meristemoidi che producono organi in particolari condizioni colturali. Simile al precedente ad eccezione del periodo necessario alla crescita del callo. Cellule cresciute in coltura in sospensione, con particolari nutrienti e ormoni, possono sviluppare milioni di embrioni individuali. Queste strutture sono chiamate embrioni somatici.

SOSPENSIONI CELLULARI Cellule cresciute in coltura in sospensione, con particolari nutrienti e ormoni, possono sviluppare milioni di embrioni individuali. Queste strutture sono chiamate embrioni somatici. Sistemi di coltura di tessuti e di cellule. La coltura di cellule vegetali sia come tessuto calloso, che come sospensione liquida è un importante tecnica preliminare alla rigenerazione dell’intera pianta. Tuttavia, a causa della possibile variabilità genetica insita nel sistema, questo tipo di coltura ha più significato nell’attività di miglioramento genetico. Mediante tale processo cellule somatiche si sviluppano gradualmente in piante attraverso gli stadi embriologici caratteristici, senza la fusione dei gameti. Tale processo implica la formazione di strutture bipolari provviste sia di apice radicale che di apice caulinare indispensabili al normale sviluppo della plantula. A partire dallo stadio globulare, è possibile osservare la progressione della polarità attraverso uno stadio a cuore, a torpedo fino alla formazione dei cotiledoni e la completa differenziazione della plantula.

Durante l’organogenesi appaiono talvolta dei cloni diversi dalle linee parentali: sono delle varianti somatiche (variabilità somaclonale), che provengono da cambiamenti genetici nelle cellule dei meristemi (modificazione del numero dei cromosomi nel nucleo, mutazioni a livello di alcuni loci genici, cambiamenti a livello dei geni extranucleari nei cloroplasti o nei mitocondri, cambiamenti epigenetici). Molte varietà coltivate derivano da varianti somatiche: il pompelmo rosa, il mandarancio, la pesca nettarina (o nocepesca). Questa tecnica è ampiamente utilizzata in floricoltura. ORGANOGENESI

Il mezzo di coltura dovrà indurre una dedifferenziazione delle cellule specializzate in modo da far riacquistare la capacità meristematica o embriogenetica.

ORGANOGENESI INDIRETTA Tessuti organizzati come foglie, radici, fusti ecc... perdono la loro struttura specializzata per accrescersi sottoforma di un ammasso di cellule disorganizzate. L'induzione e la crescita del callo è favorito dalla presenza nel mezzo di coltura di elevate concentrazioni di auxine e basse di citochinine. Ogni specie necessita di un determinato apporto di sostanze specifiche e di particolari condizioni ambientali. Il fenomeno dell'organogenesi può essere diviso in due fasi: la prima detta di induzione e la seconda di determinazione. Durante la prima fase una o più cellule riacquistano la capacità di dividersi dando origine a centri meristematici. Nella seconda fase i centri meristematici acquistano una polarità indirizzandosi verso la formazione di un apice radicale o apicale. ORGANOGENESI DIRETTA E' una metodologia volta all'ottenimento di germogli o radici, direttamente da tessuti messi in coltura, senza passare attraverso le fasi di callo. L'assenza di proliferazione disorganizzata assicura una discreta stabilità genetica. La capacità di rigenerazione diretta è caratteristica di un numero ristretto di specie e limitato ad alcuni tessuti. Ogni specie necessita di un determinato apporto di sostanze specifiche e concentrazioni ottimali di ormoni. L'induzione e la crescita di germogli è generalmente favorita da un rapporto citochinine/auxine a favore delle prime. ORGANOGENESI

Si utilizzano marcatori molecolari per monitorare complessi caratteri poligenici negli individui maturi con genotipi superiori in termini di quantità e qualità della produzione (come altezza, forma della chioma, qualità del legno o della frutta) e di risposta agli stress: vengono poi analizzati gli individui giovani per gli stessi marcatori e quelli che presentano le caratteristiche desiderate vengono fatti propagare. L’impiego di marcatori di tipo ormonale e/o basati sull’espressione genica possono essere utili nella propagazione degli alberi da frutta per identificare stadi e tessuti competenti per una propagazione efficace su vasta scala di materiale esclusivo, certificato e garantito. La grande variabilità genetica liberata dalle colture "in vitro" può essere sfruttata per il miglioramento genetico delle piante coltivate, con il notevole vantaggio di lavorare in poco spazio su un altissimo numero di genotipi differenti. Le procedure utilizzate per la selezione si basano sull'uso di sostanze o di metaboliti ai quali possono sopravvivere solo mutanti resistenti. Ad oggi concreti risultati sono stati ottenuti nella selezione di specie resistenti ad avversità biotiche ed abiotiche come elevate concentrazioni di sali nel suolo, carenza idrica, tossine, molecole di pesticidi. SELEZIONE DI GENOTIPI FAVOREVOLI MARCATORI MOLECOLARI

Identificazione di marcatori molecolari Selezione assistita Identificazione di genotipi Organizzazione ed evoluzione del genoma vegetale Architettura Produzione di legno Qualità della frutta MIGLIORAMENTO GENETICO Approcci biotecnologici per manipolare tratti di interesse agronomico

Il rischio più grave della propagazione vegetativa è quello della diminuzione della variabilità genetica. È dunque necessario, oltre al perfezionamento delle tecniche di produzione di massa di alcune specie di piante, creare delle banche di geni per conservare i patrimoni ereditari indispensabili al mantenimento della variabilità genetica. CONSERVAZIONE DELLA VARIABILITÀ GENETICA Preservare piante legnose in campo richiede grandi terreni ed è molto costoso, la crioconservazione è considerata l’alternativa alla conservazione a lungo termine del germoplasma vegetale. Nella crioconservazione i processi metabolici, biochimici e di divisione cellulare sono arrestati. Questo permette di conservare il materiale vegetale per lunghi periodi evitando deterioramento o modificazioni.

FASI della CRIOCONSERVAZIONE SCELTA DELL’ESPIANTO Possono essere utilizzati diversi tipi di espianti: apici, cellule in sospensione, embrioni immaturi, embrioni somatici, calli, gemme, peli radicali, semi, granuli pollinici. I più utilizzati sono gli apici di 1-3 mm, per la loro stabilità genetica, il basso contenuto d’acqua e l’alta percentuale di sopravvivenza. PRETRATTAMENTO Gli espianti sono inizialmente cresciuti per un breve periodo in un terreno arricchito di agenti osmotici, questo abbassa il livello di acqua nei tessuti. In alcuni casi viene aggiunto a questi terreni acido abscissico che riduce il tasso di crescita e sembra ridurre gli effetti negativi della deidratazione. PROCEDURE CRIOGENICHE Sono state messe a punto diverse procedure per portare i tessuti a una temperatura di circa -190°C, le principali sono: two-step freezing, vitrification, encapsulation-dehydratation e encapsulation- vitrification.

Two-Step Freezing Questo metodo prevede un passaggio di raffreddamento lento a circa -30°C, seguito da un rapido raffreddamento in azoto liquido. Richiede apparati di raffreddamento costosi e molte volte si ha la formazione di ghiaccio durante la fase lenta. Vitrification Il materiale è trattato con una soluzione crioprotettiva (vitrification solution) nella quale il tessuto vivo può essere raffreddato senza la formazione di ghiaccio. La soluzione esterna richiama acqua dalle cellule e favorisce la deidratazione, le sostanze crioprotettive sono in quantità non tossiche ed hanno pesi molecolari molto bassi che permettono una rapida penetrazione all’interno dei tessuti. La durata del trattamento con la soluzione vitrificante è un parametro critico e avviene a circa 0°C. Il componente più usato di questa soluzione è il DMSO (dimetilsolfossido). Encapsulation-dehydratation Questo metodo prevede l’incapsulazione del materiale vegetale in sfere di alginato di calcio. Le sfere sono poi deidratate e successivamente raffreddate. Questa procedura è meno complicata e costosa rispetto agli altri metodi e non prevede l’utilizzo di sostanze tossiche. Encapsulation-vitrification Questo metodo combina le tecniche di incapsulamento e vitrificazione. L’inclusione del materiale nelle sfere riduce gli effetti tossici della soluzione di vitrificazione e aumenta quindi il tempo di esposizione allo stress osmotico.

CRIOCONSERVAZIONE

Panis et al. 2005

Martins et al STABILITÀ GENETICA Alcune tecniche prevedono l’uso del dimetilsolfossido come sostanza crioprotettiva, tuttavia si sospetta che induca cambiamenti genetici.

Fernández et al STABILITÀ GENETICA

Guo et al Boyko et al STABILITÀ GENETICA METILAZIONE DEL DNA

Istituto Sperimentale per la Frutticoltura (Roma)

BIBLIOGRAFIA Hartman HT and Kester DE (1990). Propagazione delle piante. Edizioni agricole della Calderini s.r.l.. Shibli RA, Al-Ababneh SS and Smith MAL(2004). Cryopreservation of plant germplasm: a review. Agricultural science 31: Panis B, Piette B and Swennen R (2004). Droplet vitrification of apical meristems: a cryopreservation protocol applicable to all Musaceae. Plant Science 168: 45–55. Martins M, Sarmento D and Oliveira MM (2004). Genetic stability of micropropagated almond plantlets, as assessed by RAPD and ISSR markers. Plant Cell Rep 23: 492–496. Fernández ME, Figueiras AM and Benito C (2002). The use of ISSR and RAPD markers for detecting DNA polymorphism, genotype identification and genetic diversity among barley cultivars with known origin. Theor Appl Genet 104: 845–851. Boyko A, Kathiria P, Zemp FJ, Yao Y, Pogribny I and Kovalchuk I (2007). Transgenerational changes in the genome stability and methylation in pathogen-infected plants. Nucleic Acids Research 35: 1714–1725. Guo WL, Wu R, Zhang YF, Liu XM, Wang HY, Gong L, Zhang ZH and Bao Liu (2007). Tissue culture-induced locus-specific alteration in DNA methylation and its correlation with genetic variation in Codonopsis lanceolata Benth. et Hook. f. Plant Cell Rep. Tutte le fotografie mancanti di referenza, le fasi di micropropagazione e di crioconservazione sono a cura della sezione di propagazione dell’Istituto di Frutticoltura di Roma (CRA): Damiano C, Caboni E, Palombi MA, Monticelli S, Gentile A, La Starza S, Frattarelli A, Condello E.