TOLLERANZA AL LATTOSIO Alimentazione e evoluzione

Outline  Che cos’è il lattosio  Che cos’è la lattasi  Traduzione e processamento dell'enzima lattasi  Regolazione del gene della lattasi (LCT)  Che cos’è la tolleranza al lattosio e test diagnostici  Evoluzione della tolleranza al lattosio  Basi genetiche della tolleranza al lattosio  L'allele T  T in Italia  La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente  La complessa storia della persistenza della lattasi in Africa  Il gene dell’amilasi (AMY1)

Che cos’è il lattosio? Il lattosio è il principale disaccaride presente nel latte È formato da un’unità di glucosio e una di galattosio GalattosioGlucosio

Che cos’è il lattosio? % lattosio cammello 4 mucca5 cavallo6 uomo7 Dairy Products Calcium ContentLactose Content Yogurt, plain, low-fat, 1 cup415 mg\\5 g Milk, reduced fat, 1 cup295 mg11 g Swiss cheese, 1 oz270 mg\\1 g

Che cos’è la lattasi? Galattosio Glucosio LATTASI (LPH) Circolo sanguigno Il lattosio viene idrolizzato nei sue due monosaccaridi (Galattosio e Glucosio) dall’enzima Lattasi Florizin-idrolasi (LPH)

Che cos’è la lattasi? L’enzima viene sintetizzato dalle cellule epiteliali intestinali processato nel reticolo endoplasmatico e nell’apparato di Golgi Enzima maturo Troelsen et al.(2005) PROCESSAMENTO (maturazione): L'insieme delle modificazioni post-traduzionali cui va incontro un polipeptide neo-sintetizzato per produrre la proteina matura ed attiva.

Che cos’è la lattasi? Troelsen et al.(2005) Cellula epiteliale intestinale

Traduzione e processamento della lattasi (a)Traduzione dell’mRNA e traslocazione sul reticolo endoplasmatico (b)Rescissione del peptide segnale N-terminale (c) N-glicosilazione (d) Formazione degli omodimeri. Reticolo endoplasmatico Troelsen et al.(2005) N-glicosilazione: L'aggiunta di una catena glucidica a livello dell'atomo di azoto di una catena laterale di asparagina.

Traduzione e processamento della lattasi II trasloco nell’apparato di Golgi (e) O-Glicosilazione. (f) Rescissione del Pro-LPH. Troelsen et al.(2005) O-Glicosilazione: Monomeri di zuccheri vengono legati al peptide a livello dell'atomo di ossigeno delle catene laterali di serina o treonina

Traduzione e processamento della lattasi Troelsen et al.(2005) Trasloco sulla membrana microvillica

Regolazione del gene LCT Il gene della lattasi florizin idrolasi (LCT) mappa su 2q21 La sua attività è regolata da un promotore subito a monte del primo esone del gene Promotore è una regione di DNA costituita da specifiche sequenze dette consenso, alle quali si legano specifici polimeri (polipeptidi, RNA etc..) responsabili della regolazione e della trascrizione di un gene

Regolazione del gene LCT GATA CE-1a Regione altamente conservata

Regolazione del gene LCT GA 2c1a 150 bp + Enhancer Un fattore di trascrizione è una proteina che lega il DNA in una regione specifica di un promotore o di un enhancer, da dove poi regola la trascrizione. ~14000 bp

OCT-1 Regolazione del gene LCT Promotore distale attività enhancer (introne 13 gene MCM6) AAGATAATGTAGCC Gli enhancer sono sequenze di DNA che svolgono il loro ruolo pro-trascrizione attraverso l'associazione con diverse proteine, tra cui diversi fattori coinvolti nell'avvio della trascrizione stessa

Che cos’è la tolleranza al lattosio? Time LPH activuty B B= Birth W= Weaning W ~ 30% Homo sapiens Mammalia ~ 70% Homo sapiens PERSISTENZA DELLA LATTASI

Che cos’è la tolleranza al lattosio? Presenza di lattasi Legame del dimero all’enzima (LPH) durante il transito intestinale Idrolisi in glucosio e galattosio Immissione del glucosio e del galattosio nel circolo sanguigno quindi nel fegato Assenza di lattasi Nessun legame col l’enzima (LPH) durante il transito intestinale Il lattosio arriva indisturbato nell’intestino Fermentazione da parte della flora batterica intestinale Formazione di gas (metano, CO2, H2)

Test diagnostici Test bioptico Test del glucosio H2 breath test BH2 parti per milione   BH2 > 20 ppm INTOLLERANTI  BH2 < 20 ppm TOLLERANTI Misura la variazione di idrogeno dopo l’assunzione di circa 50g di lattosio

Itan et al Evoluzione della tolleranza al lattosio

A) Distribuzione del fenotipo tollerante al lattosio A B B) Localizzazione dei siti Neolitici che mostrano presenza di attività di allevamento di bovini

Evoluzione della tolleranza al lattosio Adozione della pastorizia Insorgenza della mutazione Aumento in frequenza della mutazione dovuta alla selezione naturale * * * * Cultural-historical Simoons 1969 Insorgenza della mutazione Adozione della pastorizia Aumento in frequenza della mutazione dovuta alla selezione naturale * * * * Reverse cause Bayless 1971 * : LP individual

Evoluzione della tolleranza al lattosio Arid climate hypothesis Cook & al-Torki 1975 Milk as a source of food and clean, uncontaminated fluid in desertic climate Calcium absorption hypothesis Flatz & Rotthauwe 1973 Milk as source of calcium for reducing risk of rickets in high latitudes were low light levels occure

Evoluzione della tolleranza al lattosio NEOLItico? Neolitico Cambiamenti climatici dovuti alla fine del LGM hanno permesso la diffusione dell'agricoltura al di fuori della Mezzaluna fertile Le prime evidenze di attività agricola in Europa sono state trovate a Cipro, Creta e Grecia continentale circa 9000 anni fa (Price 2000) Il Neolitico inizia circa anni fa nella regione della mezzaluna fertile

Basi genetiche della tolleranza al lattosio Studi su famiglie hanno dimostrato che la tolleranza al lattosio è un tratto ereditabile e che quindi è geneticamente determinato. Il fenotipo tollerante era ereditato come un singolo gene autosomico dominante (Bayless e Rosensweig 1966) AA: fenotipo intollerante Aa: fenotipo tollerante aa: fenotipo tollerante A= gene non mutato a= gene mutato

Basi genetiche della tolleranza al lattosio Enattah et al Cromosoma 2 regione q C/T % G/A %

Basi genetiche della tolleranza al lattosio C High transcription Oct-1 DNA binding protein + Low transcription lact mcm6 T lact mcm6 C

Distribuzione dell’allele T Itan et al. 2009

Distribuzione dell’allele T Sud Est Nord Ovest Itan et al. 2009

Età della mutazione T In realtà si misura il momento in cui intorno alla variante inizia a formarsi della variabilità

Età della mutazione T T = Δ / μ Tempo (generazioni) ASD Tasso di mutazione medio

Età della mutazione T Locus 1 Locus /(10*2) Δ = 0.5

Età e origine dell’allele T Nel 2007 uno studio estensivo su 37 popolazioni a livello mondiale (9 SNPs intorno al polimorfismo C/T-13910) ha stimato l’età e l’origine della variante T Enatah et al, 2007

Età e origine dell’allele T Aplotipo Combinazione di varianti alleliche lungo un cromosoma o segmento cromosomico contenente loci strettamente associati tra loro ATTTCCCCTAGGTAGA ATTTGCACTAGGCAGA ATTTCCCCTAGGTAGA ATTTGCACTAGGCAGA Aplotipo 1 Aplotipo 2 DEFINIZIONI UTILI

Età e origine dell’allele T Filogenia: Struttura ad albero che rappresenta le relazioni evolutive tra un insieme di taxa (dove per taxon si intende un’unità evolutiva, quindi dall’aplotipo… alla specie!)

Età e origine dell’allele T AAATGTACC AAATGTGCC TAATGTGCC AAAGGTACC AAATGTACC G  T mutation A  G mutation AAATGTGCC ANCESTORE COMUNE La filogenia fornisce una dimensione temporale ed evolutiva A  T mutation

Età e origine dell’allele T The Molecular Clock Hypothesis L’ammontare della variazione genetica tra sequenze (o aplotipi) è in funzione del tempo di divergenza. Il tasso dei cambiamenti molecolari è costante (abbastanza) da permettere di predire i tempi di divergenza

Età e origine dell’allele T AAAGGTACC N=5N=2N=1 AAAGGTACT Mutazione C  T AAAGGTGCC Mutazione A  G TAAGGTACC Mutazione A  T AGAGGTACT Mutazione A  G Tasso di mutazione/anno=10 -3 Una mutazione ogni 1000 anni AAAGGTACC 4000 anni In realtà si misura il momento in cui intorno alla variante inizia a formarsi della variabilità

Età e origine dell’allele T La variante T sarebbe comparsa 2 volte in tempi diversi nella medesima regione geografica

Età e origine dell’allele T In tutte le popolazioni analizzate l’età della variante T è risultata molto recente (età max ~10000 anni fa) Risultato compatibile con la “Cultural Historical hypothesis” e con l’avvento della pastorizia

Età e origine dell’allele T Zona degli Urali e del Caucaso settentrionale

Selezione positiva dell’allele T La frequenza cresce velocemente e non lascia il tempo alla ricombinazione di spezzare gli aplotipi Aplotipi più lunghi intorno a alle varianti T-13910, aplotipi più corti intorno alle varianti C-13910

Selezione positiva dell’allele T T C-13910

T in Italia North-Eastern Italy219 Ladini (Bolzano)30 Val di Scalve (Bergamo)102 Udine53 Castelmassa (Rovigo)34 Central-Northern Italy206 Bologna95 Palazzuolo (Firenze)33 Alfero (Forlì-Cesena)41 Alta val Savio (Forlì-Cesena)37 Central Italy96 Tocco da Casauria (Pescara)38 Roma30 Norma (Latina)30 Southern Italy189 Benevento30 Albidona (Cosenza)52 Messapi (Brindisi)23 Roseto Capo Spulico (Cosenza)27 Belvedere Marittimi (Cosenza)28 Siracusa29 Sardinia 153 Gallura37 Fonni (Nuoro)116 Anagnostou et al samples ; 19 populations; 5 macroregions

T in Italia SNPs Microsatelliti

T in Italia Si definiscono microsatelliti sequenze costituite da unità di ripetizione molto corte (1-5 bp) disposte secondo una ripetizione in tandem ATTAGCCCTC A GAT A GTCTTAAGAC A ATTAGCCCTC A GAT A GTCTTAAGAC A ATTAGCCCTC A GAT A GTCTTAAGAC A GAT A 7 ripetizioni 6 ripetizioni 8 ripetizioni Evoluzione estremamente veloce ( )

T in Italia La distribuzione delle frequenze della variante T in Italia non mostra un andamento clinale omogeneo, piuttosto viene evidenziata una diversità tra il Nordest ed il resto del paese

T in Italia Datazione basata sulla simulazione del declino, nel tempo, dell’allele originariamente associato alla mutazione in ognuno dei loci STR.

T in Italia

Test di selezione che valuta se la frequenza osservata di un allele è compatibile con il suo livello di variabilità, considerando un determinato modello demografico ed assumendo una condizione di neutralità. Allele 1 Allele 2 p 1 =p 2 =10%

T in Italia Test di selezione hanno evidenziato segnali più intensi per le regioni del Nord-est Diverso utilizzo del latte Uso prevalente di latte fresco nel Nord-est (più lattosio) Uso prevalente dei derivati nel resto del paese (meno lattosio)

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Tolleranza al lattosio (dato fisiologico) Frequenza dell’allele T-13910

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Fulbe Hausa Wolof Jaali Shaigi Nuer Dinka Ireland Physiological tests Molecular tests

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente ] LCT 49.3 kb 3’ Centromere Telomere UBXD2 LOC DARS [ [ ’  3.1 kb LCT-promoter region 2.0kb bp …GT C/G CC C/T GATG T/G AATAGAA.………ACCATTGAAT G/C C… Intron kb …GGTGGC G/A CGG… Intron 9 1.3kb * bp MCM kb ] Varianti Africane bp bp bp

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente 819 individui di 63 popolazioni Africane 154 individui di 9 popolazioni Europee, mediorientali e Asiatiche Sequenziamento degli introni 9 e 13 del gene MCM6 e il promotore prossimale del gene LPH 4 microsatelliti su 252 individui Africani Test di tolleranza al lattosio su 513 individui dell’Africa orientale (Tanzania, Sudan e Kenya)

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente

Variante G-13915

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Language Kenya P/GLPLIPLNPG % Afro-asiatic64/ Nilo-Saharian126/ Niger- Kordofanian 2/21010,0 Totale192/ Language Sudan P/GLPLIPLNPG % Afro-asiatic17/ Nilo-Saharian Totale43/ Variante G Popolazioni di pastori di lingua Afroasiatica Beja Banuamir 25% Beja Hadandawa 18,2%

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Language KenyaP/GLPLIPLNPC % Afro-asiatic64/ Nilo-Saharian126/ Niger- Kordofanian 2/ Totale192/ Language Tanzania P/GLPLIPLNPC % Nilo-Saharian45/ Niger- Kordofanian 61/ Khoisan48/ Afro-Asiatic81/ Totale235/ Variante G-14010

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Kenya Lingua Afroasiatica Kenya Lingua Nilo-sahariana C Tanzania Sandawe EHH extended haplotype homozygosity

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente G G Kenya Lingua Afroasiatica Kenya Lingua Afroasiatica Sudan Lingua Afroasiatica Sudan Lingua Afroasiatica G G-13907

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente ANALISI FENOTIPO - GENOTIPO Associazione significativa per le varianti C – G – G – Associazione significativa per le varianti G – T – 956 In forte linkage con le varianti C – e G Singolarmente spiegano ognuna non più del 21% della varianza fenotipica Insieme spiegano il 45% della varianza fenotipica

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente KENYA

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente TANZANIA

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente SUDAN

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente CAUSE DELLA DISCREPANZA Errore intrinseco dei test fisiologici non invasivi Fattori fisiologici che generano falsi positivi e negativi (flora batterica intestinale che non produce idrogeno; velocità elevata di transito attraverso il tratto gastrointestinale, celiacia, infezioni gastrointestinali) Presenza di altre varianti associate alla persistenza della lattasi non ancora identificate

La complessa storia della persistenza della lattasi in Africa Alta frequenza nella penisola Arabica che suggerirebbe una sua origine in quella regione geografica Origine circa 4000 anni fa come risposta alla domesticazione del cammello Introduzione in Africa orientale circa 1400 anni fa in seguito all’espansione Araba che ha accompagnato la diffusione della religione islamica

La complessa storia della persistenza della lattasi in Africa Frequenza maggiore tra le popolazioni di lingua Afroasiatica dell’Etoipia, Sudan settentrionale e Kenya settentrionale Totalmente assente nelle altre regioni dell’Africa orientale Probabilmente originatasi nell’Etiopia orientale, tra le popolazioni di pastori di lingua Cushit che sono migrati in Sudan e Kenya circa 5000 anni fa

La complessa storia della persistenza della lattasi in Africa Presenza in Tanzania, Kenya e, a frequenze basse in Africa meridionale L’età della variante è stata stimata tra i 2700 e i 6500 anni Osservazioni in accordo con dati archeologici che pongono la diffusione delle pratiche pastorali in queste zone tra i 4500 e i 3300 anni fa (in seguito alle migrazioni di popolazioni di pastori dal Nord Africa) Origine probabilmente in Tanzania (popolazioni di lingua Cushit) e successiva diffusione

Non è ancora finita Distribuzione della tolleranza al lattosio inferita dalla frequenza di tutte e 4 le varianti Itan et al., 2010

Non è ancora finita Itan et al., 2010

Il gene dell’amilasi (AMY1)  Scinde l’amido in zuccheri semplici  Prodotta dalle ghiandole salivari e dal pancreas  Il gene che codifica per l’enzima (pos.1q21) è presente in numero di copie variabili negli individui  Esistono pattern nel numero di copie di AMY1?Esiste una correlazione con l’espressione genica?E con la dieta?

Il gene dell’amilasi (AMY1) Variazioni nel numero di ripetizione del gene AMY1 (a) Giapponese (b) Pigmeo Biaka (c) Scimpanzè

Il gene dell’amilasi (AMY1) Agricoltori Cacciatori/raccoglitori

Il gene dell’amilasi (AMY1)  Esiste,nelle diverse popolazioni una correlazione numero di copie del gene AMY1 e dieta (differenze tra cacciatori- raccoglitori e produttori di cibo)  Confrontando la differenza nucleotidica esistente tra scimpanzè- uomo (d=0,027 6MYA) e tra le differenti popolazioni (0,00011<d<0,00056) si stima una nascita della variabilità nel numero di ripetizione di AMY1 abbastanza recente.