ANIMALI TRANSGENICI Per animali transgenici si intendono quegli animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso ad altre specie.

MICROINIEZIONE DI DNA INIEZIONE DI DNA nel pronucleo maschile di un oocita appena fecondato. Più precisamente, si depositano con una microsiringa 1-2 picolitri di DNA che contengono circa copie del gene da inserire. A monte del gene ( cDNA ) da trasferire nel pronucleo si utilizza una sequenza promotore che conferisce al gene la specificità di espressione in un particolare tessuto

MICROINIEZIONE DI DNA E PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva, che darà origine alla nascita di un topino “chimera” ( mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici ; solo nell’incrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto

MICROINIEZIONE DI DNA E PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI

Dennis Roop and c-Myc Myc è un oncogene che attiva la trascrizione dei geni di stimolo di sviluppo;quando viene espresso altera la funzione usuale dello sviluppo e della proliferazione di controllo delle cellule

Studio del ruolo di c-Myc nella carcinogenesi Creazione di topi transgenici Inserimento di c-Myc umano in topo Overexpression di c-Myc nell’epidermide Risultati esperimento: -aumento di crescita cellulare -inibizione della differenziazione

TOPI KNOCK–OUT I topi knock–out sono divenuti molto utili nel contribuire a capire il genoma umano ed il relativo ruolo nelle malattie. Generando un knock-out è stato dimostrato che è possibile mirare l’inserimento del gene in una posizione precisa del genoma del topo; ciò dà la possibilità di eliminare un gene specifico con un allele inattivo o mutato. Di conseguenza gli animali Knock-out sono considerati una tecnica investigativa che tiene conto dell’eliminazione di un gene in particolare, nel tentativo di definire che effetto ha nell’organismo

CLONAGGIO DEL DNA

PLASMIDI I Plasmidi sono elementi genetici extra- cromosomici che si replicano nelle cellule batteriche autonomamente. Il loro DNA è circolare e a doppia elica.I plasmidi usati negli esperimenti di clonaggio derivano tutti da plasmidi trovati in natura che sono stati “ingegnerizzati” in modo da presentare caratteristiche che facilitino il clonaggio di geni. I più usati sono i plasmidi di E.Coli.

Caratteristiche dei plasmidi Una sequenza ORI che permette al plasmide di replicarsi nelle cellule di E.Coli in quanto viene riconosciuta dagli enzimi di replicazione della cellula ospite Deve avere un marcatore selettivo, che renda le cellule di E.Coli contenenti il plasmide, facilmente distinguibili dalle cellule che non lo contengono; uno dei marcatori più usati è il gene amp che conferisce la resistenza all’ampicillina Deve avere anche un sito di taglio per un enzima di restrizione in modo che lo si possa aprire per inserire il frammento di DNA esogeno

INSERIMENTO DEL DNA DA CLONARE

CELLULE ES Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

RICOMBINAZIONE OMOLOGA

INIEZIONE DEL DNA RICOMBINATO Le cellule staminali che hanno integrato nel loro genoma il DNA ricombinato, vengono iniettate in un embrione isolato in stadio precoce di sviluppo. L’embrione precoce, composto parzialmente da cellule ES, viene introdotto nell’utero di una femmina pseudogravida. Il topo “chimera” che si sviluppa da questo embrione conterrà alcune cellule somatiche portatrici del gene alterato e conterrà anche cellule della linea germinale che portano il gene modificato.

TOPO CHIMERA INCROCIATO CON TOPO NORMALE 1.Il topo “chimera” verrà incrociato con un topo normale e alcuni discendenti (2 su dieci) avranno un gene modificato in tutte le loro cellule ( eterozigosi). 2.Incrociando tra loro questi topi portatori del gene modificato si ottiene qualcuno dei discendenti contenente 2 geni alterati in tutte le sue cellule (omozigosi ). 3.Se l’alterazione genica originale inattiva completamente la funzione genica si avranno allora dei topi ad “eliminazione” (Knock- out) cioè ceppi di topi che hanno un certo gene inattivato definitivamente.

TECNICA KNOCK - OUT

USO DEL KNOCK-OUT NELLA COLORAZIONE DEL PELO DI TOPO Le cellule ES utilizzate hanno uno “STRAIN” con pelo di colore bianco Dopo che tali cellule sono state inserite in una blastocisti, esse si divideranno in molti tessuti differenti. Se il risultato è un topo che il pelo con macchie bianche e macchie nere vuol dire che l’iniezione di cellule ES è riuscita. Dopo l’individuazione dei topi che hanno avuto contributi da entrambi i tipi di cellule, si ha la trasmissione della germ-line per cui dall’incrocio di questi topi eterozigoti con il pelo a chiazze avremo la nascita di topi Knock-out con il pelo nero ( quindi genotipo omozigote)

TECNICA “CONDITIONAL KNOCK-OUT ” Lo scopo dei Knock-out condizionali è eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo. VANTAGGI: - topi Knock-out conditional sopravvivono più a lungo -i metodi sono anche più precisi

Il sistema di Recombinase Cre-Lox Metodo knock-out conditional piu’ usato. Si basa sull’azione del recombinase che è un enzima che funziona come le forbici tagliando un frammento di DNA inserito fra due siti LOX recombinase specifici. Poiché questo enzima è espresso soltanto in determinati tipi cellulari, il gene designato sarà eliminato soltanto da tali cellule. Quindi questa metodica è basata su un’inattivazione tessuto-specifica del gene bersaglio. In una prima fase avviene la descrizione del luogo d’interesse :il frammento di DNA compreso tra siti Lox. Successivamente avviene la costruzione del vettore bersaglio, la ricombinazione omologa in cellule ES, l’iniezione nell’embrione ad uno stadio precoce e la generazione del topo chimera. Quest’ultimo, contenete i siti Lox recombinase-specifici, verrà incrociato con un topo CRE positivo, cioè che esprime l’enzima recombinase in un tessuto specifico. L’espressione tessuto-specifica del recombinase permette l’inattivazione del gene d’interesse soltanto nel tessuto in cui la recombinase è espressa.

KO costitutivi Il limite principale dei topi transgenici KO per un gene e’ la possibile mortalita’ degli omozigoti durante lo sviluppo. Soluzione : l’induzione della mutazione tempo e tessuto specifica

KO condizionali Il sistema cre-lox Sistema che è alla base: meccanismo di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la ricombinasi Cre. Si possono ottenere dei mutanti che perdono la regione voluta solo attivando la ricombinasi Cre. Si devono costruire dei vettori con la regione genetica da eliminare con siti Lox all’esterno Con questa strategia si possono ottenere topi transgenici per geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto con l’espressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove si esprime o dove si induce Cre.

SISTEMA CRE-LOX Sistema di RICOMBINAZIONE del fago P1 CRE: ricombinasi specifica (permette la ricombinazione tra siti Lox ) cyclization recombination LoxP: locus di crossover (2 seq palindrome di 13bp + regione centrale di 8nt) locus of X-over P1 LoxP “attira” la ricombinasi CRE la quale ricombina le seq di DNA adiacenti Cre

tandem palindrome scambio su cromat. fratelli DELEZIONE INVERSIONE INTEGRAZIONE b Ma puo’ revertire! Non utilizzato per topi transgenici a b c ac a b c a d c b cba a b c ac b ac a b c -DELEZIONE se sono in tandem -INVERSIONE se sono palindrome -INTEGRAZIONE se c’è un elemento in un plasmide, e l’altro nelle seq di integrazione

G418

UTILIZZO SISTEMA CRE-LOX siti LoxP derivano da fago P1 (non esistono nel genoma animale/vegetale) quindi non possibilità di ricombinazione in altri siti del genoma

Il SISTEMA Cre-LoxP permette il controllo dell’espressione genica nello SPAZIO e nel TEMPO Utilizzo di un PROMOTORE TESSUTO SPECIFICO Utilizzo di un PROMOTORE -dipendente dallo STADIO di SVILUPPO -INDUCIBILE

DELEZIONE di un GENE TESSUTO SPECIFICA (spazio) Promotore attivo in cellule nervose

ESPRESSIONE di un GENE TESSUTO SPECIFICA (spazio)

DELEZIONE/KO programmabile ESPRESSIONE/K-IN programmabile Espressione di Cre regolata nel TEMPO/SPAZIO Espressione di Cre regolata nel TEMPO/SPAZIO

ESPRESSIONE/DELEZIONE di un GENE INDUCIBILE (tempo/spazio) Sono state prodotte proteine di fusione tra Cre e ER(T) (recettore estrogeni) La ricombinasi è confinata nel citoplasma finche’ non viene somministrato l’ormone sintetico (TAMoxifene) che riconosce il recettore e fa traslocare la proteina di fusione con la ricombinasi nel nucleo dove induce la delezione del frammento incluso tra i due siti LoxP spazio tempo

SISTEMA TET-ON/TET-OFF Sistema che deriva da Operone Tet E.Coli (se c’è tetraciclina, si attivano geni per la resistenza alla Tc) Sistema a 3 elementi: TeT-Repressor: repressore della trascrizione Tc/Dox: tetraciclina TRE: tetracycline response element Versione mutata di TetR La Tc SPEGNE il GENE La Tc ACCENDE il GENE

La Tc SPEGNE il GENE La Tc ACCENDE il GENE

TRASFERIMENTO DEL NUCLEO  clonazione Pecora Dolly: prima dimostrazione della TOTIPOTENZA del nucleo di una cellula di individuo adulto differenziata Il trasferimento nucleare è una tecnica che permette di sostituire il genoma di una cellula con quello derivante da un'altra. Viene utilizzata per generare animali clonati partendo da cellule di un individuo adulto. 1)Si allontana il NUCLEO di un ovulo 2)Si coltivano le cellule epiteliali adulte (G0) 3)Si fondono nucleo G0 + ovulo enucleato 4)Uovo rinucleato in crescita in coltura/ovidotto 5)Embrione si impianta nella madre adottiva Wilmut e collaboratori 1997 Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.

Con la tecnica del TRASFERIMENTO del NUCLEO di CELLULE SOMATICHE (SCNT) si creano dei CLONI In Natura: CLONE  GEMELLI identici in seguito a riproduzione sessuale stesso DNA mitocondriale In Laboratorio: CLONE  chi dona il nucleo/chi riceve il nucleo utilizzo tecnica SCNT DNA mitocondriale differente

CLONAZIONE per TRASFERIMENTO NUCLEARE: efficienza bassissima! 434 oociti 1 pecora 29 embrioni

IL NUCLEO DI UNA CELLULA SOMATICA ADULTA E’ STATO RIPROGRAMMATO ORIGINANDO UN INDIVIDUO ADULTO.

GLI ANIMALI CLONATI…SONO SANI???

Utilizzo di YAC per produrre TOPI TRANSGENICI 1995 Lamb e Gearhart YAC (Yeast Artificial Chromosome) x produzione di topi transgenici UTILIZZATI per TRASFERIRE GENI di grandi dimensioni Kb COME SI TRASFERISCE uno YAC nel TOPO? 1) Fusione di SFEROPLASTI (cellule Lievito senza parete) + cellule ES (rischio di contaminazione con genoma Lievito) 2) Purificazione di YAC (separato per elettroforesi) + microiniezione nel pronucleo (se YAC non ha dimensioni grandi, altrimenti si frammenta) 3) Trasferimento di YAC nelle ES tramite LIPOSOMI (vescicole lipidiche artificiali per fusione con membrana)