= Fase aploide = Fase diploide RIPRODUZIONE SESSUATA Quali vantaggi? Attraverso la ricombinazione meiotica: si creano cellule aploidi (gameti) con combinazioni nuove dei caratteri parentali, distribuite in singole serie di cromosomi; Attraverso la fecondazione: gli individui della progenie possono ricevere genotipi molto diversi dai precedenti; le nuove combinazioni possono risultare più vantaggiose -o meno- per la sopravvivenza in un ambiente che può variare in modo imprevedibile; da una progenie numerosa i cui individui presentano un’ampia varietà di combinazioni di alleli diverse dai genitori, aumenta la probabilità che almeno uno abbia l’assortimento dei caratteri adatto alla sopravvivenza.

Cellule goniali (2n) divisioni mitotiche Meiosi I (n; 2C) Meiosi II (n; 1C)

nuovo ciclo di divisione cellulare (salto di 1 fase S)

Differenze tra mitosi e meiosi. Segregazione: Genotipo: Strutture in piastra equatoriale: tra ctd fratelli: 4c =>2c; 2n => 2n tra cms omologhi: 4c => 2c; 2n => n divisione riduzionale Mitosi Meiosi I al termine della divisione: 2 ctd (2n): 2 ctd dello stesso cromosoma (n): o paterno o materno appaiamento: solo tra 2 ctd fratellitra 4 ctd (fratelli e omologhi): (sinapsi) cellule figlie 2c: genotipo eterozigote Interfase 1: cellule figlie 2c, genotipo omozigote (esclusi cross- over) Cromosomi:2n (2ctd/cms) Bivalenti: n (4 ctd/bivalente) La meiosi è preceduta da 1 fase S, l’appaiamento degli omologhi è a 4 ctd (bivalente); i ctd di ogni omologo sono orientati allo stesso polo. 1 paterno e 1 materno

Interfase pre-meiotica: svolgimento dell’ultima fase S. Profase meiotica I: appaiamento, crossing over, terminalizzaione dei chiasmi, reclutamento dei bivalenti dalle fibre del fuso. Metafase meiotica I: i cinetocori di ciascun cromosoma dei bivalenti si respingono; i cromosomi sono orientati in piastra. Anafase meiotica I: segregazione dei cromosomi omologhi, riduzione del n° cromosomico (aploide, 2 c). Interfase meiotica: duplicano solo i centrosomi. II divisione meiotica: segregano i cromatidi fratelli: cellule aploidi (1 c). Meiosi I Meiosi II

Assortimento indipendente (A): produce 2 n combinazioni diverse di gameti aploidi. (nell’uomo: 2 23 = combinazioni diverse) Crossing over (B): produce ulteriori riassortimenti tra geni nei cromosomi omologhi, aumentando il numero di combinazioni (e la variabilità). (A)(B) 2 meccanismi di ricombinazione sovrapposti : circa 5,9x10 23 Considerando in media 3 C.O. per cromosoma, il numero di combinazioni diventa: 2 (nx3) = 2 69

Le fasi della prima divisione meiotica Re-duplicazione dei centrosomi

Le fasi della seconda divisione meiotica centrosomi reduplicati

Chorthoippus parallelus. A: metafase mitotica maschile (2n=17, X/0) e B: femminile 2n=18, X/X). C-E: MEIOSI. C: leptotene; D: Zigotene iniziale, ma appaiamento ancora incompleto; E: Zigotene avanzato, con 8 bivalenti a “bouquet”. Si può notare che i telomeri sono legati ad una limitata regione della membrana nucleare. metafasi mitotiche leptotene Zigotene

Profase meiotica I in Brachaspis collinus. (colorazione: orceina acetica. Ingrandimento 1000x). (a.) leptotene: I cromosomi appaiono come una matassa di singoli fili. Il cromosoma X è eterocromatico (freccia). (b.) zigotene: Il nucleo è aumentato di volume e cromosomi omologhi sono appaiati. Il cromosoma X è ancora positivamente eterocromatico (freccia). (c.) pachitene: Gli omologhi si separano e ognuno è visibilmente costituito da due cromatidi uniti dai chiasmi, i punti di crossing-over tra cromatidi non fratelli. (c'): Interpretazione dell’immagine precedente: ogni linea rappresenta un cromatidio. Gli undici bivalenti possono essere identificati individualmente. (d.) Diplotene intermedia: I bivalenti sono contratti e i chiasmi sono più evidenti. (d '): interpretazione di 4d. La posizione dei centromeri è identificata da piccoli cerchi neri (le frecce indicano i chiasmi).

Profase meiotica I in Brachaspis collinus. (colorazione: orceina acetica. Ingrandimento 1000x). (a.) leptotene: I cromosomi appaiono come una matassa di singoli fili. Il cromosoma X è eterocromatico (freccia). (b.) zigotene: Il nucleo è aumentato di volume e cromosomi omologhi sono appaiati. Il cromosoma X è ancora positivamente eterocromatico (freccia). (c.) pachitene: Gli omologhi si separano e ognuno è visibilmente costituito da due cromatidi uniti dai chiasmi, i punti di crossing-over tra cromatidi non fratelli. (c'): Interpretazione dell’immagine precedente: ogni linea rappresenta un cromatidio. Gli undici bivalenti possono essere identificati individualmente. (d.) Diplotene intermedia: I bivalenti sono contratti e i chiasmi sono più evidenti. (d '): interpretazione di 4d. La posizione dei centromeri è identificata da piccoli cerchi neri (le frecce indicano i chiasmi).

Chorthoippus parallelus. F: pachitene appaiamento e scambi (C.O.); G: diplotene, bivalenti a 4 filamenti (ctd) e con chiasmi. H, diacinesi, i cms si accorciano e i chiasmi terminalizzano. I: metafase meiotica I, i cms sono sul piano equatoriale del fuso e i centromeri orientati verso i poli del fuso si respingono. Il cromosoma X non è appaiato (univalente). pachitenediplotene diacinesimetafase meiotica I cromosoma X il crossing over avviene in pachitene! ma si vede in diplotene, per la presenza dei chiasmi. cinetocori omologhi

In prima divisione meiotica l’appaiamento tra i due cromosomi omologhi viene completato durante la fase di zigotene. In pachitene avviene il crossing over e coinvolge regioni omologhe di cromatidi omologhi; in questa fase l’appaiamento è mantenuto per tutta l’estensione dei cromosomi. Quando il processo di scambio è completato, alla fine del pachitene, l’interazione stretta tra gli omologhi comincia ad ‘allentarsi’: in diplotene si osserva un progressivo allontanamento tra i cromosomi omologhi lungo tutta l’estensione dei cromosomi, compresa la regione centromerica: l’appaiamento è mantenuto grazie alla sola presenza dei chiasmi. Man mano che avanza la profase (verso la diacinesi) questo allontanamento determina la terminalizzazione dei chiasmi, che scivolano verso le estremità telomeriche. In diacinesi il numero visibile di chiasmi è perciò diminuito, ma l’appaiamento tra i cromosomi omologhi rimane mantenuto grazie alla loro presenza. Le frecce indicano la forte repulsione reciproca tra i centromeri omologhi. diacinesi cinetocori omologhi

Metafase meiotica I: i bivalenti sono completamente contratti; i cinetocori si respingono quasi totalmente, mentre i telomeri sono ancora uniti.

J: anafase meiotica I iniziale. K: tarda anafase meiotica I. L: interfase meiotica. M: prometafase meiotica II; i ctd sono uniti solo al centomero. N, O: metafase mei II. P anafase meiotica II. anafasi meiotiche I Anafase I: (j,k) segregazione degli omologhi ognuno dei quali è costituito da due cromatidi uniti dal centromero. Telofase I: è visibile la forma a 'V' dei cromosomi acrocentrici. Il numero di cromosomi in ciascun polo è = n. Intercinesi (L). Prometafase (M) e metafase II (N, O): I cromatidi di ciascun cromosoma sono uniti tra loro solo al centromero. (P) Anafase II: I centromeri si sono divisi e i cromatidi si sono separati ai poli opposti.

The chromosomes of GVBD and PB oocytes (mouse) treated with QDs-Tf (2.89 nmol·L - 1 ). (A) Bivalent chromosomes in meiosis I oocyte. (B) Chromosomes in anaphase I of meiosis, with two sets of dyads. (C) Normal Chromosomes in metaphase II with one set of dyads. (D) Hyperploid oocyte with 19 dyads and 2 single chromatids (arrows). Scale bar: 10µm. Theranostics 2012; 2(7): doi: /thno.4290 mouse

L’appaiamento : inizia in zigotene, a partire da punti isolati lungo gli omologhi, per poi estendersi a tutta la loro lunghezza. Durante questo processo si costituisce una struttura centrale tra i due omologhi, il complesso sinaptonemico. Durante l’appaiamento si possono osservare meccanismi di ‘correzione’ di errori, a causa della presenza di altri cromosomi che si trovano interposti tra gli omologhi: il fenomeno è chiamato ’interlocking’. La correzione di tali eventi è a carico di attività enzimatiche presenti nel complesso sinaptonemico, tra cui la topoisomerasi II.

Tsai and McKee (2011)

A bouquet makes ends meet Harry Scherthan Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, (August 2001) doi: / a | Preleptotene. Telomeres (pink) transit to the nuclear envelope after DNA replication is completed or redistribute over the nuclear periphery. Compacted, mostly separate, chromosome territories (found in mammals, yeast and some plants) start to elongate. (For simplicity, only one pair of submetacentric chromosomes is shown; red.) b | Leptotene. Telomeres of elongated chromosomes have attached randomly over the nuclear envelope. In yeast, peripheral telomere localization depends on the integrity of the telomere complex. Telomeres then move to congregate near the centrosome (orange) or its equivalent (mammals, algae, yeast); this process probably requires motor proteins and intact microtubules. Alternatively, nuclear rotations could position telomeres near the centrosome, where they get captured. During these movements, encounters between elongated chromosomes, which probably carry double-stranded DNA breaks during this period 61, contribute to homology testing and recognition. c | Zygotene. During tightest telomere clustering (bouquet) at the leptotene–zygotene transition, most terminal chromosome fractions are aligned, allowing intensive chromatin interactions. (Species that transform a Rabl orientation into the bouquet will require less time to reach this stage.) The transit from zygotene to pachytene sees the initiation and progression of synapsis and chromosome condensation, which might drive the resolution of the bouquet topology. d | Pachytene. Homologues are paired lengthwise by the synaptonemal complex. Telomeres of the paired homologues are scattered over the nuclear envelope 61

The pseudoautosomal regions, PAR1, PAR2, [1] and PAR3, [2] are homologous sequences of nucleotides on the X and Y chromosomes. Although recombination is known to be limited only to the pseudoautosomal regions (PAR1 and PAR2) of the X and Y chromosomes, a 2013 study reports allelic unequal recombination between the XTR region Yp11.2 and Xq21.3, indicating the presence of a new PAR, which has been named PAR3. [3] This PAR3 region, like PAR2, is exhibited in 2% of the general population. Also, the additional layer of justification has been provided from another study on six dyslexic cases [4] which were shown to harbor duplications and deletions in the same Xq21.3 and Yp11.2 regions through allelic unequal recombination. [1] [2]homologous nucleotidesXY chromosomes [3] [4] The pseudoautosomal regions get their name because any genes within them (so far at least 29 have been found) [5] are inherited just like any autosomal genes. PAR1 comprises 2.6 Mbp of the short-arm tips of both X and Y chromosomes in humans and great apes (X and Y are 155 Mbp and 59 Mbp in total). PAR2 is at the tips of the long arms, spanning 320 kbp. [6] [5]autosomal [6]

Pseudoautosomal regions (PARs) on the Y chromosome share homology with regions on the X chromosome and synapse with it during spermatogenesis to allow segregation of the sex chromosomes. Most of the Y chromosome is a "male-specific" (MSY) area composed of euchromatic regions containing functional genes and heterochromatic regions lacking genes. One gene in the euchromatic region is the "sex-determining region" (SRY) which encodes a testis-determining factor (TDF) that triggers differentiation of testes tissue in the embryo

diplotene

Nella struttura dei bivalenti: I cinetocori fratelli di ciascun cromosoma omologo non sono più orientati in direzione opposta, ma diventano co-orientati, cioè ‘guardano’ verso lo stesso polo. I chiasmi mantengono ancora l’appaiamento tra gli omologhi che rimangono uniti ancora solo nei telomeri

Il complesso sinaptonemico Elementi lateraliElemento centrale e fibrille laterali Nodulo di ricombinazione Cromosomi omologhi

Il nodulo di ricombinazione: Complesso multienzimatico che si sposta lungo l’asse del bivalente; è la struttura che dirige e realizza gli eventi di ricombinazione. In situazioni normali sono presenti più noduli di ricombinazione per bivalente (in media 3-4). Esistono tuttavia dei mutanti achiasmatici, i cui bivalenti ne sono privi: in questi non si osservano crossing over.

A) Profase I: sinapsi tra cromosomi omologhi, crossing-over in pachitene e bivalenti che ne derivano. A) B) progressione da metafase I verso l’anafase I; C) progressione dalla metafase II e attraverso l’anafase II fino alla telofase II, di cui sono mostrati i prodotti ricombinanti nei 4 gameti aploidi (C’). B) C) (C’) Osservazione dei cromosomi in meiosi: rappresentazione schematica. Crom. acrocentrico Crom. metacentrico

DIFFERENZE TRA PROCESSO MEIOTICO MASCHILE E FEMMINILE. differences in behaviour between human male and female germ cells during gametogenesis and meiosis. This includes in particular: the timing and continuity of events, the pairing and crossover processes, chromosome segregation, the actual gamete produced.These differences are summarised in Table 2. Meiosis in males: starts after puberty and continues throughout life; normally the production is at least 60 millions sperm daily. Meiosis in females: begins around the 12th week of fetal life until around week 20arrest at the diplotene stage begins around the 12th week of fetal life with homolog pairing, crossing-over and chiasma formation up until around week 20. Oocytes then arrest at the diplotene stage and are generally thought to undergo extensive cell death with numbers dropping from around 7 million to around 2 million at birth. puberty chromosomes line up on the MI plate and undergo the reductional division at AI just before ovulation Female meiosis does not resume until puberty, when after the mid cycle Luteinising Hormone surge, chromosomes line up on the MI plate and undergo the reductional division at AI just before ovulation, most commonly of a single oocyte. This division is asymmetrical, where most of the cytoplasm is retained by one of the daughter cells, which will form the future mature oocyte. The other daughter cell forms a small polar body, which soon degenerates. The number of oocytes ovulated are estimated to be less than 500 during the life time of women. oocytes yet again arrest at MII until fertilisation occursonce the sperm has entered the oocyte and caused activation, oocyte meiosis continues Following progression through the second prophase, oocytes yet again arrest at MII until fertilisation occurs. At fertilization, once the sperm has entered the oocyte and caused activation, oocyte meiosis continues through AII and TII, resulting in the ejection of the small second polar body but retention of the oocyte.

Table 2. Summary of the main differences between human male and female meiosis MaleFemale Meiosis is a continuous process from puberty throughout life, and can result in the production of around million spermatozoa daily. A full cycle of spermatogenesis takes approximately 120 days, of which days are spent during meiosis Meiosis can take over 40 years from start to finish and only a few oocytes actually progress to the final stages, most being lost before birth Each parent cell produces 4 gametes (spermatozoa), all divisions being equal The two cell divisions are unequal with most cytoplasm retained in the oocyte and only a minor part forming the first and second polar bodies, thus only one actual gamete is produced from each parent cell The testis contains a population of stem cells which give rise to the continuing supply of gametes Oocyte numbers appear to be limited to those present at birth with around 350 ovulating between puberty and the menopause. However in mice, recent experiments have suggested the existence of stem cells that may constitute a reserve. Chromosome synapsis is very efficient, initated near the ends of chromosomes in karyotypically normal, fertile men Chromosome synapsis is less efficient and interstitial initiation more common in females Chiasma formation is an efficient process Chiasma formation is a less efficient process Lower overall chiasma frequency Higher overall chiasma frequency Synaptonemal complexes are condensed Synaptonemal complexes are relatively decondensed, having almost twice the total length per cell compared to in males. Tendency of chiasmata to occupy preferential positions with hotspots near the ends of chromosomes Tendency of chiasmata to occupy preferential positions slightly more interstitially

The average cross-over/ chiasma / recombination frequency estimated by MLH1 analysis in human males is around 50 with a range of 40-60, while that in females is around 70 but with a much larger variation between individuals than in males. Recent SC and MLH1 observations on human fetal oocytes at the pachytene stage during fetal development also quite clearly demonstrate that failure of synapsis and chiasma formation is much more common than at the corresponding stage in males. Per assicurare una segregazione corretta in Anafase I è necessaria la presenza di almeno un chiasma per bivalente Failure of crossover/chiasma formation means that homologous chromosomes appear as disoriented univalents, leading to random rather than regular segregation. I CHIASMI

Per assicurare una segregazione corretta in Anafase I è necessaria la presenza di almeno un chiasma per bivalente One important role of chiasma/crossover formation is to link chromosome pairs in such a way that whole chromosomes are conveniently transported to daughter cells at AI. In the normally fertile human male at least one chiasma/crossover is generally formed per chromosome pair (bivalent) irrespective of its length; this chiasma/crossover is considered to be obligate to secure “regular” segregation of the chromosomes involved, by allowing the maternal and paternal chromosomes of the bivalent to be properly orientated on the MI spindle. In meiosis mono- orientation of centromeres/kinetochores is required to ensure that at the first division chromosomes segregate, rather than chromatids which segregate at the second division. There is currently no direct information on patterns of chiasmata at the MI stage in human oocytes but recent SC and MLH1 observations on human fetal oocytes at the pachytene stage (during fetal development) quite clearly demonstrate that failure of synapsis and chiasma formation is much more common than at the corresponding stage in males.

Failure of crossover/chiasma formation means that homologous chromosomes appear as disoriented univalents, leading to random rather than regular segregation. Daughter cells may thus receive a paternal, a maternal, both or none of these (non-exchanged) chromosomes. One other complication of this situation is the potential for chromatids of univalent chromosomes to undergo precocious separation followed by disoriented segregation, leading to daughter cells receiving one, two or no chromatids, instead of a whole (maternal, paternal or recombinant maternal-paternal chromosome). Segregation errors, including those of chiasmate bivalents (see Fig. 6) are particularly common in human females, underlying the high rate of aneuploid offspring in our own species.

Numbers of additional chiasmata are dependent on chromosome length Figure 6: Single-chiasma bivalent showing normal disjunction at MIAI (Meiosis I, Anaphase I). Hultén, M., Baker, H. and Tankimanova, M. (2005) Meiosis and meiotic errors. In Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Bioinformatics (online edition), Jorde, L.. B., Little, P. F. R.., Dunn, M. J. and Subramaniam, S. (Eds) John Wiley & Sons Ltd: Chichester. DOI: / X.g kinetochores are oriented towards opposite spindle poles homologus kinetochores are orientated towards the same pole Precocious sister chromatid separation leading to respectively an extra and missing chromatid in segregants

ALTERAZIONI DEL PROCESSO MEIOTICO 1. Lesioni ad APPARATI e STRUTTURE. Fuso e centrosomi. Meiosi I: appaiamento, bivalenti, noduli di ricombinazione e chiasmi; segregazione precoce o tardiva degli omologhi: conseguenze per i cariotipi risultanti (disomie in eterozigosi vs omozigosi) Meiosi II: alterazione dei processi di segregazione tra cromatidi fratelli: conseguenze per i cariotipi risultanti: disomie in omozigosi. 2. INSTABILITA’ SECONDARIA DI ABERRAZIONI CROMOSOMICHE STRUTTURALI STABILI, in meiosi I. Inversioni, traslocazioni, fusioni centriche (o Traslocazioni Robertsoniane). 3. CONSEGUENZE PER LA FERTILITÀ dovute alla compatibilità di alterazioni del cariotipo con la sopravvivenza dei gameti. 4. Compatibilità delle ALTERAZIONI DEL CARIOTIPO con la SOPRAVVIVENZA NELL’UOMO: selezione pre-, peri- e post- natale. 5. Cariotipi umani aberranti compatibili con la vita nell’uomo e PATOLOGIE UMANE associate.

a b c La segregazione di ciascun trivalente (o bivalente + univalente) è sempre sbilanciata (2:1). Il 100% dei prodotti meiotici non sono vitali perchè fortemente sbilanciati. In azzurro: facce dei cinetocori presenti in un trivalente (a), bivalente (b) o univalente (c). SCHEMA DELL’APPAIAMENTO E DELLA SEGREGAZIONE MEIOTICA per un CROMOSOMA presente in 3 COPIE La totale STERILITA’ dei TRIPLOIDI è dovuta alla presenza di 3 omologhi per tutti i cromosomi che nell’appaiamento formano: 1 trivalente (a); oppure 1 bivalente (b) + 1 univalente (c). In anafase 2 cms migrano verso 1 polo e 1 verso l’altro. (Tutti i frutti senza semi sono triploidi)

MUTAZIONI ANEUPLOIDI Consistono in variazioni non-euploidi del n° cromosomico, cioè nell’aumento o nella diminuzione del numero di cromosomi presenti nel corredo normale (2n o n), di un numero di cromosomi che sia diverso da un assetto completo. Ad esempio, l’assetto diploide 2n (o quello aploide n) può essere aumentato (o diminuito) per un n° di cromosomi variabile, compreso tra 1 e n-1. Le aneuploidie provocano generalmente gravi sbilanciamenti nel dosaggio genico all’interno del genoma e sono quasi tutte incompatibili negli animali in generale, in particolare nell’uomo. Le più tollerate sono le trisomie. Nelle piante possono essere compatibili con la vita.

In Datura stramonium, sono noti i fenotipi di tutte le trisomie possibili (n=12). NULLISOMIA n-1 DISOMIA n+1 MONOSOMIA 2n-1 TRISOMIA n+1 nei gameti In cellule diploidi (sia somatiche che germinali) (aploidi)

L’insorgenza delle aneuploidie è causata da ERRORI NEL PROCESSO DI SEGREGAZIONE (IN MITOSI E IN MEIOSI). Tra questi i principali sono: EVENTI DI NON DISGIUNZIONE E DI PERDITA CROMOSOMICA o CROMATIDICA La non disgiunzione può essere dovuta principalmente a: mal funzionamento delle fibre del fuso in mitosi (o in meiosi), sia spontaneo che indotto da colchicina (o altri veleni del fuso); alterazioni strutturali/funzionali dei cinetocori. Linea somatica: da 1 cellula 2n (cellula trisomica) (cellula monosomica) 2n-1 2n+1 gametociti gametociti: cellula 2n (2 cell. disomiche) (2 cell. nullisomiche) n-1 n+1 n-1 n+1 (1 disomica + 1 monosomica) (2 cell. normali) n n+1 n n-1 In M I + +