Bioremediation: tecnica di bonifica di matrici ambientali in cui gli inquinanti subiscono degradazione a opera di microorganismi in condizioni assistite e controllate, per ottenere prodotti innocui o meno tossici Vengono utilizzati consorzi di microorganismi capaci di metabolizzare sostanze tossiche, naturali o di sintesi. I microorganismi impiegano enzimi costitutivi o indotti spesso capaci di riconoscere anche substrati simili ai substrati naturali e di trasformarli (biotrasformazioni) Bioremediation (Biorecupero)

Dredging = rimozione dei sedimenti Capping = copertura permanente Wessels-Perelo, J. Haz. Mat., 2010

Biotrasformazioni microbiche Coprono quasi tutti i campi della reattività chimica: -Ossidazioni (alcoli, aldeidi, chetoni, catene alchiliche carbossiliche, sostituenti e gruppi funzionali, idrossilazione epossidazione, deidroalogenazione) -Riduzioni (acidi, aldeidi, chetoni, gruppi funzionali; deidrossilazione, eliminazione riduttiva, idrogenazione) -Idrolisi (eteri, esteri, ammine, lattoni) -Condensazioni (deidratazione, O- e N-acilazione, glicosilazione, esterificazione, lattonizzazione, amminazione -Isomerizzazioni (migrazione di doppi legami, racemizzazione) -Reazioni acido base

Tipi di inquinanti Inquinanti inorganici – elementi metallici e non metallici Alcuni microorganismi hanno sviluppato la resistenza ad alcuni metalli Inquinanti organici – naturali e di sintesi -I composti organici possono essere trasformati in CO 2 e H 2 O -Lenta cinetica di degradazione -Evoluzione naturale di specifici microorganismi

Biotrasformazioni che subiscono i composti organici Composti organici alifatici I composti più leggeri sono i più degradabili. La reazione comincia in condizioni aerobiche con un’ossigenasi I passaggi della degradazione sono Idrocarburo alcool aldeide acido CO 2 Negli n-alcani il primo step puo’ essere ossidazione terminale o  -ossidazione Negli alcani a catena ramificata il primo step è una  -ossidazione Negli alcheni l’attacco avviene al doppio legame o ossidazione in tratti diversi della molecola con formazione di alcoli, acidi, epossidi e dioli piu’ o meno insaturi. In condizioni anaerobiche la degradazione porta alla produzione di metano

Biotrasformazioni dei composti organici Composti organici aromatici Le fasi di degradazione aerobica sono: Ingresso nella cellula Modificazione di eventuali sostituenti (ossidazione, dealchilazione ossidativa, ossidazione di tioeteri e fosfotionati,idrossilazione, dealogenazione, nitroriduzione) Reazione di attacco dell’anello. Gli enzimi coinvolti sono mono- o di-ossigenasi che catalizzano l’introduzione di 1 o 2 OH in una reazione NADH dipendente. Nel caso delle diossigenasi si ha l’introduzione di 2 OH con formazione di cisdiidro diolo e poi di catecolo, che subirà poi la rottura dell’anello aromatico O2O2 O2O2 Le fasi di degradazione anaerobica consistono nella: Eliminazione dei sostituenti in condizioni anaerobiche Degradazione riduttiva dell’anello aromatico

Composti organici policiclici Rappresentano la maggior parte degli inquinanti, essendo presenti negli effluenti industriali, nei pesticidi. Devono essere trasformati in derivati idrossilati e poi subire la rottura del primo (dei primi) anello. La reazione di idrossilazione non richiede O 2, ma può essere utilizzato l’ossigeno di H 2 O. Le reazioni successive sono le stesse degli altri aromatici. Biotrasformazioni dei composti organici

Strategie per il biorecupero di siti contaminati da inquinanti organici Sito contaminato Composti organici recalcitranti Biodegradazione Microorganismi Conversione a prodotti utili Degradazione a H 2 S, CH 4, CO 2, H 2 O Microorganismi geneticamente modificati - biocatalizzatori

Bioremediation aerobica Si basa sulla reazione: Inquinante (datore di elettroni) + O 2 (accettore di elettroni) Inquinate ossidato +H 2 O L’inquinante organico viene utilizzato dai microorganismi come fonte di energia e di carbonio, se ci sono quantità sufficienti di O 2 e altri nutrienti. Prodotti finali: CO 2 e H 2 O

Bioremediation anaerobica Alcuni composti organici, derivanti dall’industria chimica, petrolchimica, elettronica, del legno, tessile non sono biodegradabili in condizione aerobica -Cloroalifatici tetracloruro di carbonio, cloroformio, vinilcloruro, tetracloroetano, tetracloroetilene, tricloroetilene, dicloroetilene -Cloroaromatici esaclorobenzene, policlorofenili, policlorodibenzodiossine/furani

Bioremediation anaerobica Si basa sulla reazione Inquinante clorurato (accettore di elettroni) + Composto organico (donatore di elettroni) Inquinate ridotto + HCl + composto org. ossidato L’inquinante viene utilizzato dai microorganismi anaerobici come accettore di elettroni generati dall’ossidazione di sostanze organiche utilizzate come fonte di C e di energia.

- La dealoriduzione, pur se parziale, comporta sempre una diminuzione della tossicità associata agli intermedi generati. - La cinetica di dealogenazione riduttiva è tanto più lenta, quanto maggiore è il numero di atomi di alogeno. -Le cinetiche anaerobiche di dealogenazione sono comunque molto lente e dipendono dalla concentrazione iniziale e dal grado di tossicità totale. -Talvolta è opportuno introdurre una fase di finissaggio aerobico finale per abbattere intermedi di dealogenazione ossidabili.

Wessels-Perelo, J. Haz. Mat., 2010

Inertizzazione biologica di metalli pesanti In condizioni anaerobiche batteri solfato riduttori possono utilizzare il solfato come accettore di elettroni e precipitare i metalli come solfuri insolubili, separandoli dal sistema (bioprecipitazione) Altre strategie: -biovolatilizzazione -bioassorbimento

Bioremediation Stimolo di popolazioni microbiche indigene -Biostimulation- Introduzione di microorganismi capaci di degradare gli inquinanti -Bioaugmentation-

Bioremediation Limiting Factors 1.Distribution of the waste which may limit microorganism access to the waste 2.Supply of nutrients required for metabolism 3.Toxicity of the waste due to concentration and/or type of constituents present 4.Formation and accumulation of toxic byproducts 5.Inadequate population(s) of requisite microorganisms 6.Non-competitiveness of non-survivability of inoculated cultures 7.Inadequate management of the system (7)

CLASSE DI COMPOSTI FACILIT À DI BIODEGRADAZIONE Composti monocromatici (BTEX, alcoli, fenoli, ammine) Molto facile Idrocarburi alifatici fino a C15Molto facile Idrocarburi alifatici C12-C20Moderatamente facile Idrocarburi alifatici > C20Moderatamente facile Idrocarburi monocloruratiModeratamente facile Idrocarburi policloruratiModeratamente facile Idrocarburi policromatici (IPA)Difficile PCB (bifenili poli-clorinati)Difficile PesticidiDifficile

Stimolo di popolazioni microbiche indigene Un esempio: il disastro nella Baia di Prince William, maggio 1989 La nave container della Exxon Valdez Animali dopo lo sversamento di petrolio

Tecniche di risposta: 1.Confinamento delle aree e del materiale per ridurre la migrazione degli inquinanti 2.Escavazione/estrazione del materiale inquinato e deposito in discarica 3.Stabilizzazione chimica degli inquinanti per ridurne mobilità e/o tossicità 4.Estrazione degli inquinanti, con metodi fisici (p.es. riscaldamento) o chimici (lavaggio con solventi o agenti estrattivi) e loro successiva distruzione (per via chimica, fisica o biologica) 5.Completa o parziale biodegradazione Nel caso della baia di Prince William la popolazione dei microorganismi presenti, che degradavano la resina delle conifere fu incrementata con opportuni nutrienti, rimuovendo in parte il petrolio disperso sulla costa.

Tipologie di tecniche In situ: il suolo / le acque sono trattate senza escavazione/ estrazione (approcci 3-5) Ex situ: la matrice inquinata è rimossa dal sito I trattamenti ex situ possono avvenire: On-site (cioè nel sito stesso) Off-site (in apposito impianto) Ex situ permette miglior controllo ma ha costi maggiori. Se off- site si aggiunge anche il costo del trasporto e dell’uso dell’impianto

Summary of the environmental fates of organic pollutants in soil

Bioavailability and the “weathering” phenomenon Definition: Occurrence of a compound in a state that is accessible to microbes Bioavailable = dissolved in aqueous phase Bioavailability (biodegradation potential) decreases with increasing residence time in soil = “weathering”

Mechanisms in weathering of organic chemicals Time-dependent entry of compound into a state or location that is inaccessible to microbes. Nature of sites or states hypothesized to be : small pores that restrict entry of cells regions within SOM that strongly retain the compound Microbes can’t enter aggregate Access to compound requires: 1.desorption from sorbed (solid) phase 2.diffusion to reach cells

Uso di bio-surfattanti per aumentare la biodisponibilità degli idrocarburi Il processo di biorecupero aggredisce soltanto gli inquinanti biodisponibili L’uso di surfattanti aumenta la biodisponibilità attraverso processo di desorbimento e la formazione di emulsioni Rispetto a prodotti sintetici, i biosurfattanti sono ritenuti: meno tossici per gli organismi avere maggiore compatibilità ambientale sono economicamente comparabili o vantaggiosi Uno degli svantaggi principali è che possono essere usati come fonte di C al posto dell’inquinante

Ramnolipidi Sono fra i biosurfattanti maggiormente studiati. Prodotti da batteri, anche autoctoni. Pertanto possono essere aggiunti a prodotti in situ (anche Pseudomonas e Sphingomonas)

Profilo di un sito contaminato

Le varie tecniche di bioremediation aerobica si basano sul diverso modo di somministrare ossigeno e nutrienti. In situ  Bioventing (bioventilazione)  Biosparging Ex situ  Landfarming  Biopile Vengono usate per la bonifica di siti contaminati da idrocarburi

1.- Bioventing Tecnologia operante in situ che fornisce ossigeno e, se necessario, nutrienti minerali ai microrganismi presenti nel terreno. E’ particolarmente indicata per suoli insaturi contaminati da idrocarburi. Non e’ adatta su terreni di matrice eterogenea o poco permeabili. La portata di aria deve essere bassa per minimizzare volatilizzazione Il bioventing e’ impiegato anche su terreni edificati, ha un basso impatto ambientale e un costo contenuto. Tempistica nell’ordine dei mesi Injection-based

Monitoraggio: p.es. ossigeno consumato nell’emissione

Alcuni Vantaggi Rimediazione di composti volatili (allontanati per trasporto) e non-volatili, purchè scarsamente solubili. La presenza di fabbricati può aumentarne l’efficienza Può essere effettuata contemporaneamente a trattamenti di acque di falda Alcuni svantaggi/limiti Dipende dalla popolazione microbica indigena Forte dipendenza dalla geologia del sito

Trattamento acque: airstripping Exhaust Air Heater Fan Contaminated groundwater Packing material Treated water Packed tower  Extraction well GAC column Contaminated groundwater 32 Volatilizza sostanze presenti in acqua (meglio se poco solubili, p.es. CCl 4 )

2.- Biosparging (Air sparging - bioinsufflazione) Tecnologia analoga alla precedente che si applica in situ accelerando l’ azione della flora batterica autoctona con immissione di aria o ossigeno e nutrienti. Si adotta su contaminanti adsorbiti dalle particelle del terreno sotto il livello di falda. I risultati di questa tecnologia sono condizionati dalla permeabilita’ della matrice da trattare, dalla distribuzione degli inquinanti, dalla concentrazione e dalla loro biodegradabilita’.

Accoppiamento di bioventing e biosparging

Processi a ricircolazione di acqua

Meccanismi di rimozione Gasoline Mineral spirits JF-4 Diesel No. 6 fuel oil Stripping/ volatilization Biodegradation% Removal

Control Intermediate Maximal Time Compound loss Controllo dati

FattoreCondizioni FavorevoliCondizioni sfavorevoli Profondità dall’acquifero > 3 m< 1,5 m Volatilità dei contaminanti AltaBassa Solubilità dei contaminanti BassaAlta BiodegradabilitàAltaBassa Permeabilità del suolo> cm/sec< cm/sec Tipo di suoloSabbiosoArgilloso Condizioni per l’uso di biosparging

Ex-situ Bioremediation Bringing contaminated soil to surface and treating it above ground

3.- Landfarming Tecnologia ex situ che prevede la disposizione di strati di terreno contaminato e di contaminanti su una superficie impermeabile e l’ adozione di procedure idonee a creare e mantenere condizioni ottimali per lo sviluppo delle popolazioni microbiche. Devono essere assicurati: il corretto bilanciamento dei nutrizionali di sistema, il trasferimento di ossigeno alle popolazioni microbiche mediante rimescolamento del materiale o aggiunta di agenti adatti a facilitare il passaggio dell’ aria e dei gas prodotti dalla decomposizione dei contaminanti (bulking agents), un tenore di umidita’ e pH ideale per i processi naturali. La tecnologia, che richiede superfici adeguate e impone sistemi di drenaggio e raccolta delle acque meteoriche, non e’ adatta in presenza di contaminanti volatili, pericolosi per la salute degli operatori.

Sezione verticale di un bacino di landfarming

4.- Biopile In questa tecnologia, derivata dal Landfarming, il terreno viene sovrapposto inserendo alternativamente tubi forati per distribuire nel materiale contaminato aria e soluzioni di acqua e nutrienti e tubi di estrazione dell’ aria dall’ ammasso. L’ acqua di ricircolo viene riutilizzata in bioreattori ai quali viene fornito ossigeno. L’ aria estratta viene trattata ed immessa in atmosfera. Per contenere l’ emissione di sostanze volatili la biopila viene coperta con teli di plastica e i vapori sono trattati con carboni attivi. Si tratta della tecnica piu’ diffusa di bioremediation quando le condizioni del terreno impediscono soluzioni in situ. Non e’ adatta a contaminazioni con elevate concentrazioni di idrocarburi. Tempi: fino a 2 anni

Allestimento di una biopila per la bonifica mediante compostaggio statico di un terreno contaminato

Processo di compostaggio ad aerazione forzata con strati sovrapposti

The biopile assessment. a-b: the confination system in the bottom. c-d: the re-circulation system for nutrient and inoculant release.

5. Biobarriere reattive (barriere biologiche) Una biobarriera è costituita da una zona di trattamento formata nel sottosuolo mediante aggiunta di microrganismi, di nutrienti e/o di reattivi, che favoriscono lo sviluppo in situ dei batteri in grado di degradare i composti organici Il riempimento è costituito da materiale a superficie specifica tale da consentire l’adesione della biomassa Questa tecnologia può utilizzare anche i principi della bioaugmentation

Da Tyagi M. et al. Biodegradation, 2011

Metodi per individuare le popolazioni microbiche presenti nei suoli contaminati Determinazione dei microorganismi totali:  esame al microscopio del campione  tecnica di fumigazione  diluzione del campione e crescita su piastra il problema del tipo di terreno di coltura Determinazione di microorganismi specifici per composti recalcitranti: La quantità totale di microorganismi non fornisce informazioni sufficienti sulle capacità biodegradative. E’ necessario individuare le specie attive nei confronti di quello specifico xenobiotico.

Metodi per individuare le popolazioni microbiche attive nei confronti di inquinanti specifici  Crescita in coltura liquida – vengono utilizzati terreni di coltura contenenti lo xenobiotico come principale fonte di C, facendo diluizioni successive del campione – la crescita viene monitorata misurando la torbidità  Crescita su mezzi solidi – Il mezzo di crescita solido contiene lo xenobiotico come unica fonte di C. Vengono contate le colonie che si formano sulla piastra. Se lo xenobiotico (es. idrocarburi aromatici policiclici) non e’ solubile in acqua puo’ essere spruzzato sulla piastra.

Metodi per individuare le popolazioni microbiche attive nei confronti di inquinanti specifici  Determinazione della presenza di DNA per degradazioni specifiche. Possono direttamente essere individuati i geni batterici che codificano per enzimi capaci di degradare il composto xenobiotico. Viene estratto il DNA da campioni di suolo, purificato e, attraverso PCR, è possibile amplificare i geni specifici.  Determinazione della presenza di RNA per degradazioni specifiche. Permette di determinare l’attività enzimatica di microorganismi, anzichè la sola presenza. Data la bassa stabilità dei campioni di RNA risulta di piu’ difficile applicazione del precedente.

Polymerase Chain Reaction - PCR La PCR è essenzialmente una tecnica di amplificazione del DNA PCRamplificazione DNA (singola molecola) Moltemolecole

Cos’è la PCR (Polymerase Chain Reaction) ?  E’ una tecnica per l’amplificazione “in vitro” di specifiche sequenze di DNA, attraverso la simultanea estensione di filamenti complementari di DNA.  Il metodo fu inventato da Mullis e colleghi della Cetus Corporation nel 1983, sfruttando una reazione naturale compiuta dalla DNA polimerasi 3’ 5’ 3’ primer DNA polimerasi 5’ 3’ dNTP mix+ Mg 2+

L’invenzione della PCR Ideata da Kary Mullis nel 1983 Premio Nobel per la chimica nel 1995 Libro del 1998 ("Ballando nudi nel campo della mente. Le idee (e le avventure) del più eccentrico tra gli scienziati moderni")1998

Procedimento della PCR DNA RNA DNA Estrazione del DNA o DNA o RNA dal campione Rivelazione Amplificazione Reverse transcription

COMPONENTEVOLUMEConcentrazione finale 10 X PCR Buffer 5l5l 1X 10 X dNTPs (2mM) 5l5l 200M Forward primer (5 pmols/l) 5l5l 0.5M Reverse primer (5 pmols/l) 5l5l 0.5M (25pmols/50l) DNA genomico stampo 2l2l 1g1g polimerasi termostabile (5U/l) 0.2l 1 unità H 2 O (a 50l di volume finale) 27.8l TIPICA MISCELA DI REAZIONE

Schema di una reazione PCR Usando 2 primers che si appaiano a filamenti complementari di DNA, vengono sintetizzati 2 nuovi filamenti. Se il processo viene ripetuto, sia il campione di DNA che i nuovi filamenti possono servire come templati, portando ad un aumento esponenziale di prodotto che termina con le posizioni definite dai primers. Prodotti con il primer solo ad un’estremità e quindi di lunghezza indeterminata aumentano in maniera lineare durante il processo e, insieme al DNA di partenza, formano solo una piccola frazione del prodotto della PCR.

PCR Cycles

I cicli della PCR 30–35 cicli ciascuno comprendente: –denaturazione (95°C), sec –annealing (50–65°C), sec –polimerizzazione (68-72°C), il tempo dipende dalla lunghezza del frammento

Thermal cycler, AppliedBiosystems

Elettroforesi su gel : Separa le molecule per dimensione separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA separation verticale --> Acrilamide = DNA, proteine ed RNA le molecole più piccole migrano nel gel più velocemente

Elettroforesi su gel: visualizzazione diretta delle molecole separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA

Il DNA colorato con bromuro di etidio emette una fluorescenza di colore rosso-arancio se sottoposto a luce UV

Detection of 238-bp dioxygenase amplicons by PCR and hybridization using primers DEG-F and DEG-R. Lane M, 100- to 3,000-bp marker (Bio-Rad); lanes 1 to 8, P. putida HS1, P. putida mt-2, P. aeruginosa JI104, Pseudomonas sp. strain IC, P. putida P35X, Pseudomonas sp. strain CF600, P. putida H, and Pseudomonas sp. strain PpG7, respectively. Agarose gel (1.5% agarose) of the amplicons with approximately equal amounts of DNA in each lanePseudomonas 23CAT-F5′-CGACCTGATCTCCATGACCGA-3′ 23CAT-R5′-TCAGGTCAGCACGGTCA-3′ DEG-F5′-CGACCTGATC(AT)(CG)CATGACCGA-3′ DEG-R5′-T(CT)AGGTCA(GT)(AC)ACGGTCA-3′ Mesarch et al. Appl Environ Microbiol. 2000

Andreoni & Gianfreda Appl Microbiol Biotechnol (2007)

Introduzione di microorganismi nei siti contaminati (bioaugmentation) Vantaggio: permette di introdurre microorganismi geneticamente modificati, con geni estranei (introduzione di plasmidi o trasposoni). Fattori ambientali possono influenzare e ridurre il potenziale biodegradativo dello strain introdotto nell’ambiente. Fattori importanti: volume dell’inoculo, vitalità delle cellule (protezione delle cellule incapsulandole in granuli di polimeri) Introduzione dei microorganismi nelle radici delle piante (metodo di trasporto, metodo di protezione)

Trasferimento di geni specifici in microorganismi Trasformazione. Il DNA puo’ ssere trasferito in cellule batteriche la cui membrana è resa permeabile (competenti). Questo processo puo’ essere utilizzato per introdurre plasmidi che portano geni degradativi, conferendo al microorganismo la capacità di biodegradare inquinanti specifici Coniugazione. Il trasferimento di DNA avviene da una cellula all’altra, attraverso canali detti pili nei batteri gram-negativi e per contatto diretto nei gram-positivi. Perche’ cio’ possa avvenire deve essere presente l’operone tra. Il trasferimento consente di trasferire alcune delle proprieta’ della cellula donatrice alla cellula accettrice. Trasduzione.Il trasferimento di DNA è mediato da un virus (fago). Il fago riceve accidentalmente DNA batterico dalla cellula ospite e, infettando un sedondo ospite, lo trasferisce a questo, dove viene incorporato nel DNA cromosomiale