VETTORI NON VIRALI

Vettori: veicolo per l’introduzione e l’espressione di un gene

VETTORI PER TERAPIA GENICA Vettori virali: Vettori non virali: Adenovirus Retrovirus Virus adeno-associati Lentivirus (derivati da HIV) Herpesvirus Plasmidi nudi Elettroporazione in vivo Liposomi Amine, proteine cariche positivamente

VETTORE IDEALE Tropismo di espressione: per garantire la localizzazione del transgene sia a livello trasduzionale (il vettore infetta cellule specifiche), che a livello trascrizionale (il gene viene espresso solo in alcune cellule). Durata di espressione: per far sì che la terapia duri nel tempo. Livello di espressione: possibilmente regolabile. Efficacia clinica: test funzionali su modelli animali. Scarsa tossicità.

Durata della Trasduzione Stabile o Transiente Espressioni stabili sono preferibili per malattie metaboliche Espressioni transienti sono preferibili per vaccini e tumori L’espressione dipende anche dalla replicazione cellulare

Geni Reporter Strumento utile per valutare l’avvenuta trasfezione, stabile o transiente ●Il gene reporter deve codificare per una proteina che non abbia analoghi funzionali nella cellula trasfettata ●Rivelazione con un sistema semplice e sensibile ●La proteina non deve interferire con il normale metabolismo cellulare

Geni Reporter Luciferasi: il gene luc, clonato dalla lucciola,codifica per un enzima che può essere facilmente rivelato fornendo il substrato Luciferina e rivelando l’emissione luminosa B-galattosidasi: L’enzima prodotto da questo gene catalizza la digestione di substrati come l’X-Gal che genera un prodotto colorato Green fluorescent protein (GFP): proteina autofluorescente

Trasfezione transiente Utilizzando un vettore che contiene un gene reporter è possibile fare studi di espressione nelle 48 h successive alla trasfezione Trasfezione stabile Richiede che il gene sia integrato nel genoma della cellula ospite. In genere il gene reporter codifica per un enzima che conferisce la capacità alla cellula di crescere in un terreno selettivo

Fasi fondamentali per il trasferimento genico in sistemi non virali ●Impacchettamento del DNA ●Ingresso nelle cellule ●Eventuale rilascio dalle vescicole lisosomiali ●Trasporto nel nucleo ●Espressione del gene

Barriere Cellulari ed Extracellulari membrane citoplasmatiche e nucleari, lisosomi, endonucleasi. barriera ematoencefalica, il sistema immunitario e fluidi corporei

VETTORI NON VIRALI Plasmidi nudi Promotori forti virali (CMV) Bassi livelli di transgene, somministrazione locale Durata di espressione limitata Tossicità molto bassa Efficacia clinica solo quando sono necessarie basse quantità di transgene o immunizzazione E’ facilmente degradate dalle nucleasi dell’ospite: bassa efficienza

VETTORI NON VIRALI Plasmidi nudi Applicazioni: Vaccini a DNA Espressione di molecole ad alta bioattività (ormoni) Terapia locale (tumori)

Precipitazione con Fosfato di Calcio 1973: Graham e van der Eb misero a punto il protocollo di precipitazione con fosfato di calcio: Il DNA viene mescolato ad una soluzione di CaCl2 e poi aggiunto ad una soluzione fisiologica contenente tampone fosfato. Si forma un precipitato costituito da fosfato di calcio e DNA che viene posto in contatto con le cellule da trasfettare. I precipitati sono incorporati da alcune cellule per endocitosi.

Precipitazione con Fosfato di Calcio Vantaggi: Economico Svantaggi: ●L’efficienza bassa ●Elevata citotossicità Tecnicamente delicato, sono determinanti: Taglia e dimensioni del precipitato Variazioni anche minime del pH Non funziona con alcuni tipi cellulari come i linfociti

DEAE-destrano Primo metodo utilizzato per l’introduzione massiva di DNA in un cellula eucariotica Destrano: polisaccaride costituito da unità di D-glucosio che associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile) è in grado di legare il DNA e di mediarne l’ingresso attraverso le membrane. Le cellule vengono preparate mediante shock osmotico con glicerolo o DMSO Vantaggi: molto semplice Svantaggi: poco efficiente solo trasfezioni transienti

METODI NON VIRALI Metodi fisici Metodi biochimici Metodi chimici

Metodi Fisici Pressione idrodinamica Metodo balistico   Metodi Fisici Pressione idrodinamica Metodo balistico Trasferimento mediato attraverso un campo elettrico Iniezione diretta nei tessuti

Metodi Biochimici polilisine associate a ligandi "transferrinfection" (infezione specifica mediata dal recettore per la transferrina) Il DNA è coniugato con proteine che possono entrare nelle cellule per endocitosi. Vantaggio: di essere specificatamente indirizzati a determinate cellule, e tale specificità non è possibile con i metodi chimici.

Metodi Chimici liposomi cationici policationi come DEAE dextrano, polietilenimmina complessi di polilisina

Pressione Idrodinamica ●Uso di volumi di iniezione estremamente elevati (equivalente al totale volume del sangue) ● Iniezione rapida ● Sistema ampiamente utilizzato per il gene delivery epatico ● Alta efficienza di “delivery” anche nelle cellule muscolari e renali

Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery G Zhang1, X Gao1, YK Song2, R Vollmer1, DB Stolz3, JZ Gasiorowski4, DA Dean4 and D Liu1 Gene Therapy (2004) 11, 675–682

L’iniezione idrodinamica comporta cambiamenti nella funzione cardiaca e della pressione venosa: il volume iniettato che consente un efficiente rilascio epatico è approssimativamente uguale al totale volume del sangue di topo

L’iniezione idrodinamica causa una transiente alterazione cardiaca

Effetto della iniezione idrodinamica sulla pressione venosa

Un valore di pressione di circa 40 mm Hg si ottiene con un volume di iniezione corrispondente al 10% del peso corporeo

Formazione di pori di membrana

MICROINIEZIONE Il DNA viene inserito direttamente nel nucleo della cellula: viene automaticamente superato il limite della barriera citoplasmatica e della degradazione lisosomiale. Trasduzione di singole cellule: linee germinali per ottenere animali transgenici.

Metodi Balistici Gene Gun Sistema della camera a vuoto

Parametri Fondamentali ●Velocità con cui la particella colpisce il target: Proiettili Velocità di accelerazione/decelerazione Distanza del target ●Rivestimento dei proiettili: Influenza fortemente l’efficienza ●Numero di particelle che entrano nel tessuto: Equilibrio tra efficienza e vitalità cellulare

Sistema della camera a vuoto Sistema che accelera microproiettili d’oro o di tungsteno rivestiti di DNA su un bersaglio posto in una camera sottovuoto

METODI BALISTICI GENE GUN: Bombardamento con particelle d’oro su cui è stato adsorbito Il DNA Lo sparo è ottenuto con un’onda supersonica di elio, che passando all’interno della cartuccia, proietta fuori il contenuto

METODI BALISTICI: APPLICAZIONI Vaccinazioni a DNA Terapia genica suicida Immunomodulazione

Elettroporazione in vivo Plasmidi con cassette di espressione Campo elettrico permealizza le cellule Somministrazione locale Livelli di transgene più alti Durata di espressione prolungata Tossicità molto bassa (scarica elettrica) Efficacia clinica solo quando sono necessarie basse quantità di transgene o immunizzazione

Elettroporazione in vivo Parametri: ●Intensità di voltaggio ● Pulsazione\s (ampiezza, numero, frequenza) ● Configurazione dell’elettrodo ● Sito di rilascio Tutti i parametri vanno valutati per ogni applicazione

ELETTROPORAZIONE IN VIVO Principio

ELETTROPORAZIONE IN VIVO Strumentazione e Applicazioni A e B: strumenti per elettroporazione C: elettroporazione in pelle D: elettroporazione in muscolo

Intensità di Voltaggio Time Course

Trials clinici indicano l’avanzamento dell’elettroporazione in vivo per gene transfer •Il primo studio clinico è stato iniziato nel 2004 al H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute: I phase in pazienti con melanoma con metastasi sottocutanee accessibili. L’obiettivo primario è quello di determinare la tossicità e la massima dose tollerabile del plasmide codificante per IL-12 umana. Altri trials clinici: •Rilascio intramuscolare di vaccini per il cancro alla prostata (University of Southampton, UK) •Tumori esprimenti HER-2 e\o antigeni carcino-embrionario

Elettroporazione in vivo VETTORI NON VIRALI Elettroporazione in vivo Applicazioni: Vaccini a DNA Espressione di molecole ad alta bioattività (ormoni) Terapia locale (tumori) Terapia locale (muscolo)

VETTORI NON VIRALI Lipidi cationici Formano dei liposomi con una superficie carica positivamente che consente l’associazione, senza internalizzazione, con il DNA e media l’interazione con la membrana plasmatica

Liposomi

F DURANTE LA PREPARAZIONE E LA CONSERVAZIONE STABILITA’ DEI LIPOSOMI I liposomi possono presentare problemi di stabilità: F        IN VIVO   F        DURANTE LA PREPARAZIONE E LA CONSERVAZIONE I liposomi preparati con fosfolipidi naturali (fosfatidilcolina) sono: •Facilmente permeabili ai mezzi biologici •Facilmente riconosciuti e fagocitati dalle cellule del sistema reticolo-endoteliale

Per aumentare la stabilità in vivo dei liposomi è possibile aggiungere ai fosfolipidi naturali: 4            •colesterolo   •lipidi a catena alchilica lunga e satura che stabilizzano il doppio strato riducendo la possibilità di attacco da parte delle lipoproteine ad alta densità In questo modo c’è una minore possibilità di adsorbimento delle opsonine e quindi del riconoscimento delle cellule del SRE

4          l’assenza di carica superficiale diminuisce la capacità di interazione con le cellule del RES, la presenza di carica negativa (e a volte anche di quella positiva) facilita la cattura da parte dei macrofagi 4            liposomi di dimensioni superiori a 200 nm sono più facilmente riconosciuti e catturati dai macrofagi. Liposomi di dimensioni inferiori a 100 nm risultano stabili in vivo.

Quindi la stabilità in vivo dei liposomi dipende da: •Composizione della fase lipidica •Carica superficiale •Dimensioni

Per aumentare la stabilità in circolo dei liposomi, recentemente, è stato proposto di rivestire la superficie con polimeri idrofili (es. PEG) che sono in grado di impedire la interazione dei liposomi con le opsonine responsabili del riconoscimento da parte delle cellule del RES. In questo modo i liposomi diventano invisibili e non vengono attaccati e rimossi dal circolo e per questo sono anche detti stealth o a lunga circolazione (LCL). Questa condizione è indispensabile per progettare sistemi a rilascio prolungato.

Liposomi Vantaggi: Si può usare in sistemi cellulari dove il fosfato di calcio e il destrano non funzionano bene come nel caso di cellule in sospensione Bassa tossicità Svantaggi: La produzione non è semplice Efficienza bassa Passaggio critico: incapsulamento DNA

PREPARAZIONE DEI LIPOSOMI Dissoluzione fosfolipidi e altri componenti liposolubili in un solvente organico molto volatile (es. cloroformio) Evaporazione del solvente in evaporatore rotante FILM LIPIDICO Idratazione con soluzione acquosa tamponata a T›Tm sotto agitazione Sonicazione ed evaporazione LIPOSOMI LUV LIPOSOMI MLV Sonicazione LIPOSOMI SUV

VETTORI NON VIRALI Lipidi cationici Dominio idrofobico Spacer Dominio cationico

Vantaggi dei liposomi cationici ●Presentano un elevato profilo di sicurezza rispetto ai vettori virali ●Possono contenere DNA di grandi dimensioni ●La trasfezione non richiede la divisione cellulare

Limiti dei liposomi cationici Il principale limite dei sitemi liposomiali consiste nella scarsa selettività

Lipidi cationici associati a DNA VETTORI NON VIRALI Lipidi cationici associati a DNA

VETTORI NON VIRALI liposomi Applicazioni: Vaccini (infezione di macrofagi) Vaccini antitumorali Terapia ex-vivo

VETTORI NON VIRALI Poliamine Proteine cariche positivamente che legano il DNA Coniugate con un ligando che da la specificità di tropismo Durata di espressione discreta Livelli di espressione bassi Tossicità molto bassa Efficacia clinica solo quando sono necessarie basse quantità di transgene

VETTORI NON VIRALI Poliamine Ligando Spacer Dominio cationico

Poliamine associate a DNA VETTORI NON VIRALI Poliamine associate a DNA

VETTORI NON VIRALI Poliamine Applicazioni: Vaccini a DNA Vaccini antitumorali Terapia ex-vivo

Transferrinfection ●Metodo di trasfezione che utilizza il pathway fisiologico per l’endocitosi recettore transferrina (Tf)-mediato. ● Tf è legato chimicamente a policationi che condensano il DNA. ● Polylysine (Tf-pLys) e polyethylenimine (Tf-PEI).

Policationi peptidici Vantaggi: Riconoscimento specifico della cellula Svantaggi: Limite dovuto al tipo di impacchettamento del DNA che ne influenza la traslocazione in membrana Necessità di coadiuvanti che favoriscano il rilascio del complesso nel citoplasma

Trasfezione con PEI Macromolecola organica con elevata capacità di cariche positive: ogni tre atomi c’è un gruppo amminico che può essere protonato Il complesso PEI-DNA all’interno dell’endosoma si lega ai protoni stimolando l’ingresso degli ioni cloro, questo porta alla rottura dell’endosoma con conseguente rilascio del complesso nel citoplasma

Trasfezione con PEI Vantaggi: Svantaggi: Favorisce il passaggio citoplasma-nucleo Non ostacola l’espressione genica Poco costoso Svantaggi: Efficienza non sempre elevata Può essere citotossico

VETTORI NON VIRALI Vantaggi Tossicità minima o assente Facili da produrre Buona trasduzione di alcuni tipi cellulari Non ci sono limiti alla grandezza del transgene Utili per terapia locale

VETTORI NON VIRALI Svantaggi Livelli bassi di espressione Espressione transiente