Sorgenti Sorgente EI (impatto elettronico) Sorgente CI (ionizzazione chimica) Sorgente FAB (fast atom bombarment) Sorgente electrospray (ElectroSpray Ionization) Sorgente MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization)

Sorgente FAB Sorgente MALDI Sorgente ESI Non richiedono volatilizzazione

Sorgenti: Analizzatori: Le diverse tecniche in cui è suddivisa la MS differiscono principalmente per due fattori: Il modo in cui la molecola è ionizzata Il modo in cui è misurato il rapporto massa/carica Sorgente Analizzatore Sorgenti: Sorgente EI (Ionizzazione Elettronica o Impatto Elettronico) Sorgente CI (Ionizzazione Chimica) Sorgente FAB (Fast Atom Bombarment) Sorgente ESI (ElectroSpray Ionization) Sorgente MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization) Analizzatori: Analizzatore magnetico Analizzatore a quadrupolo Analizzatore a trappola ionica (ion-trap) Analizzatore TOF (time of flight – tempo di volo)

FAB MS Le molecole polari (come peptidi, glicosidi, saponine) con pesi molecolari fino a 10000 Da possono essere analizzate mediante una tecnica “morbida” di ionizzazione chiamata bombardamento con atomi veloci.

FAB MS Il campione è sciolto in un solvente poco volatile detto matrice (glicerina). Una goccia di questa soluzione è introdotta nella sorgente e qui è investita da un flusso di atomi pesanti neutri (xeno) prodotti da una apposita “pistola atomica”

Gli atomi veloci sono prodotti dal cosiddetto cannone atomico in cui viene introdotto il gas, Ar (argon) o Xe (xeno), che per effetto di una sorgente elettronica, diventano radicali cationi di argon (Ar+.) oppure di xeno (Xe+.). Questi ioni vengono fatti entrare in una camera di collisione in cui è presente Argon o Xeno gassoso; gli ioni, urtando gli atomi cedono la loro energia cinetica generando così un flusso di atomi neutri che escono dalla camera di collisione ad elevata velocità ed impattano contro la matrice che contiene disperso il campione da analizzare. Alla fine della camera di collisione vi è un potenziale positivo che provvede a respingere eventuali ioni che con si siano scontrati con Xe o Ar gassoso.

Le matrici del FAB Glicerolo C3H8O3, m/z 92.0473 La matrice più usata nel FAB Scelta migliore per i composti polari Utilizzabile per FAB positivi e negativi Problemi per la formazione di addotti che complicano la lettura degli spettri Tioglicerolo C3H8O2S, m/z 108.0245 maggiore acidità più volatile del glicerolo Problemi per la formazione di addotti che complicano la lettura degli spettri

Nello spettro FAB, come in quello CI non si vedono ioni molecolari ma ioni pseudomolecolari [M + H]+ formati per protonazione della molecola sotto indagine; inoltre si formano e vengono esaminati anche ioni negativi che saranno del tipo [M - H]-. Quindi a seconda del tipo di ione esaminato, si parla di FAB + e FAB -. La scelta del tipo di FAB da effettuare dipende naturalmente dal tipo di molecola: Molecole cariche (sale di ammonio quaternario o un solfato organico) – FAB + o FAB – Molecole neutre (glicosidi) non si può facilmente prevedere quale ione sia meglio esaminare (esperienza e studio della letteratura)

Esempio di FAB+ su una molecola, un peptide, che non darebbe sicuramente alcuno spettro EI per la sua scarsa volatilità

Oltre allo ione pseuomolecolare [M+H]+, nel FAB+ sono spesso visibili ioni del tipo [M+Na]+ e [M+K]+, dovute all’addizione alla molecola di uno ione Na+ o K+ invece che di un protone (piccole quantità di sali di sodio e di potassio sono presenti in quasi tutti i campioni). Lo ione [M+Na]+ si colloca 22 unità di massa atomica al di sopra dello ione [M+H]+, e quello [M+K]+ 16 unità di massa al di sopra di quello [M+Na]+. Queste differenze, che sono costanti, permettono di riconoscere questi picchi.

Vantaggi e svantaggi Analisi di molecole poco volatili Analisi di molecole molto polari (complementare all’EI e CI) Bassa sensibilità Limite di massa registrabile: 2000-3000 Dalton Interferenza della matrice

Interferenza della matrice Un problema della sorgente FAB è il suo elevato rumore di fondo. Questo è dovuto alla presenza della matrice, che per quanto poco volatile dà comunque luogo ad un intenso picco [Matr+H]+; inoltre due, tre, quattro, cinque, ecc. molecole di matrice si possono unire per dare picchi del tipo [2Matr+H]+, [3Matr+H]+, [4Matr+H]+, [5Matr+H]+, ecc, che sebbene di intensità decrescente sono intensi almeno fino al tetramero; per la glicerina, questo corrisponde a picchi a m/z 93, 185, 277, 369, 461, ecc. Questi picchi rendono difficile l’interpretazione dello spettro soprattutto a masse basse (diciamo minori di 400), per cui il FAB è poco adatto a molecole molto piccole

Spettro di massa FAB + del glicerolo [Matr + H]+, [2Matr + H]+, [3Matr + H]+, [4Matr + H]+

Il FAB è quindi essenzialmente adatto a molecole polari, che siano solubili nella matrice e possano ionizzarsi facilmente. Un altro requisito è che debbano avere una massa medio alta: il limite inferiore è 400, poiché al di sotto di questo valore il rumore di fondo è troppo elevato. Le molecole adatte ad essere analizzate con il FAB includono glicosidi, peptidi, oligonucleotidi, alcaloidi.

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Tecnica di elezione per lo studio di molecole polari di elevato peso molecolare quali peptidi, proteine, acidi nucleici ed oligonucleotidi Fornisce informazioni cruciali quali: determinazione del peso molecolare sequenziazione controllo della purezza (ad esempio delle sintesi automatizzate) Accoppiata ad un analizzatore a tempo di volo (Time Of Flight) consente di analizzare molecole con massa compresa tra 100 ed i 1x106 Dalton NESSUN LIMITE TEORICO AL RANGE DI MASSA

La sorgente MALDI prevede l’irradiazione con luce laser (l 337 nm) di una piccola superfice (100 mm di diametro) sulla quale viene posto il campione cristallizzato con una matrice. La matrice assorbe energia dall’irradiazione della luce laser, si riscalda e può agire conseguentemente come donatore di protoni formando ioni pseudomolecolari di tipo [M+H]+. Per composti con una elevata affinità per i cationi si possono formare anche addotti di tipo [M+Na]+, [M+K]+.

Si ha il trasferimento di protoni tra la matrice ed i campioni che vengono quindi ionizzati per protonazione formando ioni pseudomolecolari [M+H]+. Le molecole che posseggono gruppi funzionali fortemente acidi possono essere analizzate anche in negativo sottoforma di ioni pseudomolecolari [M-H]-

La matrice nel MALDI acido a-ciano-idrossicinnamico (CHCA) PEPTIDI E PROTEINE acido sinapinico (SA) OLIGONUCLEOTIDI acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) USO GENERALE Affinchè una molecola possa essere utilizzata come matrice MALDI è necessario che contenga un cromoforo in grado di assorbire la radiazione elettromagnetica emessa dalla sorgente laser.

La ionizzazione mediante MALDI è fondamentalmente diversa dalle altre tecniche di ionizzazione in quanto è una tecnica impulsiva: non fornisce una flusso continuo di ioni come EI, FAB, o electrospray (come vedremo), ma gli ioni vengono generati tutti in una volta in un tempo di pochi ns. Per questo gli analizzatori visti finora, che richiedono un flusso continuo di ioni, non sono adatti a questa sorgente, ed al MALDI è quasi sempre associato uno specifico tipo di analizzatore, l’analizzatore a tempo di volo (chiamato TOF dall’inglese time of flight).

Il TOF L’analizzatore a tempo di volo TOF (Time Of Flight) può essere descritto come un tubo rettilineo, al cui interno è come al solito fatto il vuoto. Ad un estremità si trova la sorgente, e subito dopo una zona di intenso campo elettrico che serve ad accelerare gli ioni. Nel resto del tubo non c’è campo elettrico, per cui ogni ione continua a viaggiare con la velocità acquistata nella zona di accelerazione. Al termine del tubo c’è un detector, capace di misurare con grande accuratezza il momento in cui ogni ione arriva. Si basa sul principio che ioni di differente m/z acquistano, nella fase di accelerazione, differenti velocità. Pertanto, gli ioni più pesanti cioè quelli con rapporto m/z maggiore impiegano più tempo ad arrivare all’altra estremità del tubo, rispetto agli ioni più leggeri cioè con rapporto m/z minore. Hanno cioè un tempo di volo maggiore. Il tempo di volo rappresenta quindi una misura diretta del rapporto m/z dello ione.

TUBO DI VOLO Gli ioni con rapporto m/z minore acquistano maggiore velocità in sorgente e quindi raggiungono per primi la fine del tubo di volo ed il detector. Il software dello spettrometro calcola il rapporto m/z degli ioni in funzione del tempo di percorrenza nel tubo di volo.

Principali cause che riducono la risoluzione Vantaggi e svantaggi Senza limite teorico di massa registrabile Buona sensibilità Problemi nella deposizione della matrice e del campione Bassa risoluzione Principali cause che riducono la risoluzione Ioni con lo stesso rapporto m/z che partono dalla sorgente in tempi diversi Ioni con lo stesso rapporto m/z che acquistano diversa energia cinetica (velocità) in sorgente Generazione di ioni metastabili che frammentano durante il volo

Come fare per aumentare la risoluzione? Due accorgimenti tecnologici hanno permesso di superare brillantemente i problemi legati alla bassa risoluzione: Time Delayed Extraction Reflectron mode

Time delayed extraction Si usa per evitare che ioni dello stesso tipo partano in tempi diversi dalla matrice Ciò è dovuto al fatto che il laser riscalda prima una certa zona del pozzetto i cui ioni partiranno logicamente prima di quelli ottenuti da zone più lontane da quella di incidenza del laser

Time delayed extraction Il delayed extraction consiste nell’applicare un voltaggio a monte della zona di accelerazione in modo da “trattenere” tutti gli ioni prodotti. Nel momento in cui viene rimosso il voltaggio gli ioni lasceranno la sorgente contemporaneamente. NOTATE IL GRANDE AUMENTO NELLA RISOLUZIONE DELLO SPETTRO

ElectroSpray Ionization - ESI Il campione è introdotto come soluzione sciolto in un solvente volatile (acqua, metanolo, acetonitrile, cloroformio) contenente un pò di acido organico (acido acetico). Questa soluzione è spinta ad alta pressione attraverso un ago capillare e ne fuoriesce sotto forma di aerosol (goccioline di diametro di 1-2 μm). Tra l’ago e il mantello della camera (elettrodo cilindrico) è creata una differenza di potenziale di alcuni KV che induce sulle goccioline un eccesso di carica positiva. A causa delle loro ridotte dimensioni, il solvente evapora rapidamente da ogni gocciolina che diventa sempre più piccola; la densità di carica aumenta finchè diventa così alta da determinare l’espulsione di ioni di soluto dalla gocciolina. Gli ioni così prodotti sono poi spinti attraverso un sistema di fenditure fino ad entrare nella zona a bassa pressione dove sono accelerate verso l’analizzatore

Analizzatore a Quadrupolo L'analizzatore a quadrupolo consiste in un tubo rettilineo in cui è fatto il vuoto ed in cui sono presenti quattro barre parallele, disposte simmetricamente intorno all'asse del tubo, di sezione circolare oppure iperbolica. Le barre diametralmente opposte sono in contatto elettrico tra di loro, mentre tra barre adiacenti è applicata un voltaggio formato da due componenti: una differenza di potenziale continua e una oscillante ad alta frequenza. Lo ione entra nell'analizzatore parallelamente all'asse z, ed è spinto dai campi elettrici continuo e oscillante a seguire una traiettoria a spirale .

Una delle caratteristiche dell’ESI è la possibilità di generare ioni multicarica. Per molti composti il numero di cariche è proporzionale alla grandezza del composto in esame per cui il rapporto m/z degli ioni che arrivano all’analizzatore è dell’ordine di 500-2000. Inoltre il numero di cariche assunte dalla molecola dipende sia dalla presenza di gruppi basici che dal pH del solvente. La capacità di generare ioni multicarica è un aspetto favorevole in quanto è possibile studiare molecole la cui massa sia >> rispetto al range dello strumento (0-2000 Da).

La presenza dei picchi multicarica rende più complesso il lavoro di interpretazione degli spettri in quanto la stessa molecola può comparire nello spettro in numerosi picchi dovuti ad un diverso numero di cariche Qual è la massa

Ricorda Per molecole di massa incognita, è possibile stabilire il numero di cariche dello ione dal valore di m/z del primo picco isotopico (M+1). Ad esempio per un peptide di massa incognita registriamo uno ione molecolare a m/z 1001. In tal caso potremmo trovarci nel caso in cui il peptide pesi 1000 e lo ione molecolare corrisponda allo ione [(M+H)]+ oppure il peptide pesi 2000 ed ha addizionato 2 cariche [(M+2H)]+2 (m/z 1001). La soluzione deriva dalla massa del picco isotopico: nel primo caso sarà a valori di m/z 1002 mentre nel secondo caso lo troveremo a valori di m/z 1001.5.

Vantaggi e svantaggi Analisi di molecole molto grandi Elevata sensibilità senza interferenza delle matrici Assenza di frammentazione Accoppiamento con HPLC Sistemi MS/MS Formazione di ioni multicarica misti con riduzione della sensibilità