TELOMERITELOMERI Strutture specializzate costituite da DNA associato a proteine, localizzate all’estremità dei cromosomi lineari. Lunghezza tra 3 e 20Kb; Composte da ripetizioni in tandem di sequenze ricche in G; TTAGGG Sequenze altamente conservate, specie- specifiche: nei vertebrati e nell’uomo TTAGGG (altre: TTGGGG e TGAGGG). Cromosomi umani ibridati in situ con una sonda fluorescente (giallo) di DNA telomerico. Si può notare la duplicità dei segnali di ibridazione per ciascuna estremità dei cromosomi. Nel nucleo invece i segnali sono singoli (in basso), indicando che i cromosomi non sono replicati (in G1).

Ai telomeri sono associate diverse funzioni, tra cui: 1.protezione delle estremità della doppia elica dall’attività di esonucleasi, conferendo stabilità alla molecola lineare del DNA (stabilità del genoma); 2.permettere una replicazione completa della doppia elica del DNA, ad ogni generazione cellulare; proteggere “se stessi” (essere conservati); 3.proteggere i cromosomi anche da riordinamenti strutturali (per riparazione ricombinativa con altre estremità); 4.Contribuire al posizionamento specifico dei cromosomi nel nucleo interfasico; in profase meiotica essi appaiono associati alla membrana nucleare; 5.Crescita e senescenza cellulare. Ai telomeri sono associate diverse funzioni, tra cui: 1.protezione delle estremità della doppia elica dall’attività di esonucleasi, conferendo stabilità alla molecola lineare del DNA (stabilità del genoma); 2.permettere una replicazione completa della doppia elica del DNA, ad ogni generazione cellulare; proteggere “se stessi” (essere conservati); 3.proteggere i cromosomi anche da riordinamenti strutturali (per riparazione ricombinativa con altre estremità); 4.Contribuire al posizionamento specifico dei cromosomi nel nucleo interfasico; in profase meiotica essi appaiono associati alla membrana nucleare; 5.Crescita e senescenza cellulare. telosoma TTAGGG Struttura specializzata chiamata telosoma costituita da sequenze di DNA ricche in G (nei vertebrati: TTAGGG)n e di proteine specifiche. telosoma Attraverso interazioni con molti altri fattori cellulari, il telosoma permette una regolazione dinamica del cromosoma e il mantenimento della sua integrità.

Il capping: protegge le estremità dall’attacco da parte di esonucleasi; garantisce il mantenimento e l’integrità dell’informazione delle regioni adiacenti, più interne, attraverso le generazioni durante i cicli di replicazione, poiché il problema del progressivo accorciamento delle estremità è risolto (controbilanciato) dall’elevato numero di ripetizioni; crea siti di interazione con proteine ed attività enzimatiche specifiche del telomero, tra cui la telomerasi. Tutte queste funzioni sono possibili grazie alla loro struttura, costituita di un elevato numero di ripetizioni in tandem della sequenza ricca in GC che permette la realizzazione del ‘capping’ grazie alla capacità di assumere la conformazione strutturale a loop. 5’ 3’ AACC C C 5’ TTG G G G G G T T G G G G TT

ACCORCIAMENTO DEL TELOMERO

La lunghezza dei telomeri varia molto tra specie, da ~ bp nel lievito a Kb nell’uomo. I telomeri eucariotici terminano con un filamento di DNA 3' ‘overhanging’ a singolo filamento, essenziale per il ‘capping’ e per la conservazione del telomero stesso. Sono state identificate numerose proteine che si legano sia al DNA telomerico a singolo che a quello a doppio filamento, preposte ad entrambe le funzioni di conservazione e capping del telomero. il DNA telomerico è una sequenza duplex (nei vertebrati: 5'-TTAGGG-3 ‘) ripetuta in tandem che termina con un overhang 3‘ a singola elica. Questo forma un loop all’indietro e invade la regione duplex, formando una struttura lazo, il T-loop telomerico. Allo stesso tempo, la parte corrispondente del filamento dal 5 ‘al 3' nella parte invasa si sposta [denominato D-loop (Displacement)]. Quest’ultimo costituisce la regione telomerica di DNA a singola elica. D-loop

Il risultato dell’incapacità della DNA polimerasi alfa ad aggiungere nucleotidi al termine di molecole di DNA lineare è che ad ogni ciclo di replicazione i telomeri perdono circa bp. Questo spiega l'insorgenza della senescenza cellulare replicativa, come descritto da Hayflick nel 1965, impartita dal persistente accorciamento dei telomeri per assenza di telomerasi funzionale ad ogni ciclo di divisione cellulare (l'erosione dei telomeri può verificarsi anche attraverso altri meccanismi, come insulti genotossici, e lo stress ossidativo). In particolare sembra che sia l’erosione del filamento ‘overhang’ 3’ TTAGGG a segnalare la senescenza cellulare, piuttosto che la riduzione complessiva delle ripetizioni nel doppio filamento della struttura dei telomeri. Limite di Hayflick

Mentre nella maggior parte dei procarioti non sussiste alcun necessità di protezione di estremità libere, per via della circolarità del loro DNA, nei cromosomi lineari degli eucarioti si è evoluto un meccanismo che evita l’accorciamento rapido del cromosoma, attraverso l’aggiunta un numero molto elevato di BREVI SEQUENZE su ciascuna delle estremità. Mentre nella maggior parte dei procarioti non sussiste alcun necessità di protezione di estremità libere, per via della circolarità del loro DNA, nei cromosomi lineari degli eucarioti si è evoluto un meccanismo che evita l’accorciamento rapido del cromosoma, attraverso l’aggiunta un numero molto elevato di BREVI SEQUENZE su ciascuna delle estremità. Una piccola parte di organismi batterici (come Streptomyces e Borrelia) ha cromosomi lineari e possiede dei telomeri, molto diversi da quelli eucariotici per struttura e funzioni. La struttura dei loro telomeri assume la forma delle proteine legate alle estremità lineari, loop di DNA a singola elica disposto a forcina, posti alle estremità dei cromosomi. TELOMERASI Queste brevi sequenze ripetute, inoltre, possono essere “estese” ad ogni ciclo di replicazione, grazie alla presenza di particolari attività enzimatiche, le TELOMERASI, che possono compensare il progressivo accorciamento del DNA telomerico ad ogni ciclo di replicazione.

È composto da due subunità principali, necessarie e sufficienti per l’allungamento dei telomeri: 1) la componente trascrittasi inversa (hTERT) e 2) la frazione ribonucleo- proteica (TERC o hTR), contenente un filamento di RNA, che in parte serve come stampo per l'aggiunta dei repeats esanucleotidici. La telomerasi è un complesso proteina-RNA, contenente uno stampo di RNA che permette la sintesi di una sequenza telomerica (unità di ripetizione) di DNA ricca in G. Le unità di ripetizione dei telomeri, addizionate dalle telomerasi, differiscono nei vari organismi e sono comunque ricche in G (GGGTTG in Tetrahymena; GGGTTA nell’uomo, C 1-3 A nel lievito).

Il meccanismo di azione della telomerasi (sequenza di Tetrahymena)

Telomere structure and microscopic appearance. A, Simplified schematic diagram of telomere structure and subcellular location. Telomeres are located at the ends of linear chromosomes; in humans, they are composed of hundreds to thousands of tandem DNA repeat sequences: hexameric TTAGGG in the leading strand and CCCTAA in the lagging strand. Additional protective proteins are also associated with telomeric DNA and are collectively called shelterin (TRF1, TRF2, TIN2, POT1, TPP1). The 3′ end of the telomeric leading strand terminates as a single-stranded overhang, which folds back and invades the double-stranded telomeric helix. B, Telomeres can be directly visualized under the microscope at the ends of metaphase chromosomes (4 telomere signals per chromosome) by fluorescence in situ hybridization.

Alla regione duplex di questo DNA sono legati direttamente i fattori TRF1 e TRF2 (Telomeric Repeat binding Factors). TRF1 è un regolatore negativo della lunghezza dei telomeri; TRF2 ne protegge l'integrità, cooperando alla formazione del T-loop. Infine POT1 (Protection Of Telomeres 1) si lega alla regione a singola elica. POT1 è implicata sia nella attivazione sia nell’inibizione della telomerasi. Altre proteine o si legano direttamente al DNA telomerico o alle TRF.

Telomeri: strutture complesse e dinamiche. Il ‘core’ consiste di sei proteine legate al DNA telomerico che interagiscono dinamicamente con altri fattori proteici, che includono: 1)DNA repair proteins’, 2)DNA processing enzymes’, 3)single- stranded DNA binding proteins’ e, nell’uomo, la 4)tankyrase’. La Tankyrase modifica laTRF1 rilasciandola dal DNA telomerico; questo contribuisce al cambiamento conformazionale della struttura telomerica, promuove l’accesso della telomerasi all’ estremo 3′ a singolo filamento del telomero. 1) 2) 3) 4)

L’accorciamento dei telomeri nell’uomo può indurre la senescenza replicativa che blocca la divisione cellulare. Questo meccanismo sembra prevenire l'instabilità genomica e lo sviluppo del cancro in cellule umane senescenti, limitando il numero di divisioni cellulari. In ogni modo, i telomeri più corti sono riconosciuti dai checkpoint del danno al DNA, come le chinasi ATM/ATR*: queste attivano percorsi di senescenza delle cellule attraverso p53, attivando p16INK4a/pRB e l'apoptosi. Le cellule maligne che evadono questo meccanismo di arresto diventano immortalizzate. In queste cellule l’estensione dei telomeri è dovuta prevalentemente alla attivazione della telomerasi (trascrittasi inversa responsabile della sintesi dei telomeri). Tuttavia nel 5-10% dei tumori umani si attiva un sistema alternativo di allungamento dei telomeri (ALT), percorso mediato da ricombinazione. * ATM= Ataxia Telangiectasia Mutant; ATR =ATM and Rad3-related; sono delle chinasi considerate come “sensori” del danno al DNA.

STRUTTURA della telomerasi La telomerasi (umana) consiste di due parti: 1) human Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT) e 2) Telomerase RNA (hTR or TERC), oltre alla discherina. Aggiungendo hTR, hTERT è in grado di aggiungere una sequenza 5'- TTAGGG all’estremità 3'dei cromosomi. Lo stampo della regione hTR è 3'-CAAUCCCAAUC-5'. L’espressione di hTERT, la subunità catalitica dell’oloenzima della telomerasi umana, ripristina l’attività telomerasica, induce l’allungamento del telomero, che a sua volta aumenta l’arco di vita ‘replicativa’ di cellule normali, evitando la senescenza cellulare. Si ritiene verosimile che l’espressione di hTERT contribuisca direttamente all’oncogenesi permettendo alle cellule pre-cancerose di proliferare oltre il loro naturale limite di Hayflick. hTERT è un polipeptide che si ripiega intorno al filamento di hTR, costituito di un lungo filamento di RNA (451 nucleotidi) poichè il gene hTR non viene tradotto. TERT ha una struttura che le permette di avvolgersi intorno al cromosoma, in grado di addizionare repeats telomerici a singolo filamento. Da studi comparativi sulla sua struttura sembra che la telomerasi sia di origine retrovirale.

Altre proteine presenti e coinvolte nella regolazione della funzione telomerasica (discherina, EST1 A / B) non sono però necessarie per l'allungamento dei telomeri di per sé. La componente ad RNA (hTR o TERC) del complesso è espressa in modo ubiquitario in tutte le cellule umane, ma: l'attività telomerasica è repressa nelle cellule somatiche normali, è espressa in modo caratteristico nelle cellule germinali, in cellule staminali embrionali, in alcune cellule adulte emopoietiche e in alcuni fibroblasti umani. Di conseguenza, nelle cellule somatiche la lunghezza dei telomeri tende a diminuire con l'età, mentre può essere mantenuta nelle cellule spermatiche umane. L'attività della telomerasi può essere trovata in cellule ematopoietiche normali e in fibroblasti umani, dimostrando che può essere anche un elemento centrale nella regolamentazione del controllo della durata della vita replicativa delle cellule umane normali. In alcuni casi, inoltre, la presenza della telomerasi non ha alcun effetto sull’allungamento del telomero: nei linfociti B e T si osserva infatti che i telomeri continuano ad accorciarsi anche in presenza di telomerasi attiva.

JOO-SHIK SHIN et al: Pathology (April 2006) 38(2), pp. 103–113 The role of telomeres and telomerase in the pathology of human cancer and aging When the critical length is bridged, telomeres trigger DNA repair and cell cycle checkpoint mechanisms that result in chromosomal fusions, cell cycle arrest, senescence and/or apoptosis. Should senescence be bypassed at such time, continued cell divisions in the face of dysfunctional telomeres and activated DNA repair machinery can result in the genomic instability favourable for oncogenesis. The longevity and malignant progression of the thus transformed cell requires coincident telomerase expression or other means to negate the constitutional telomeric loss. Practically then, telomeres and telomerase may represent plausible prognostic and screening cancer markers. Furthermore, if the argument is extended, with assumptions that telomeric attrition is indeed the basis of cellular senescence and that accumulation of the latter equates to aging at the organismal level, then telomeres may well explain the increased incidence of cancer with human aging. Cellular senescence, the state of permanent growth arrest, is the inevitable fate of replicating normal somatic cells. Postulated to underlie this finite replicative span is the physiology of telomeres, which constitute the ends of chromosomes. The repetitive sequences of these DNAprotein complexes progressively shorten with each mitosis.

I telomeri e le telomerasi svolgono un ruolo decisivo nei processi di iniziazione e immortalizzazione, oltre che nel mantenere la condizione di ‘immortalità’ delle cellule cancerose. La telomerasi è una trascrittasi inversa che estende i telomeri; è molto raro il processo di immortalizzazione di cellule normali attraverso l’attivazione spontanea della telomerasi endogena. Tuttavia cellule normali possono perdere la capacità di essere regolate per via di mutazioni di geni del controllo del ciclo cellulare, quali p53, pRB, p21, p16 ed altri geni. Le cellule così trasformate acquisiscono una capacità di moltiplicazione indefinita e un’instabilità del genoma, oltre ad un’alta mortalità cellulare. Attraverso questi processi alcune cellule diventano immortali per attivazione della telomerasi endogena, oppure attraverso un meccanismo alternativo che ‘recupera’ i telomeri, basato sulla ricombinazione (alternative lenghtening of telomere, ALT).

Telomeres, the DNA-protein complexes located at the end of linear eukaryotic chromosomes, are essential for chromosome stability. Until now, telomeres have been considered to be transcriptionally silent. We demonstrate that mammalian telomeres are transcribed into telomeric repeat-containing RNA (TERRA). TERRA molecules are heterogeneous in length, are transcribed from several subtelomeric loci toward chromosome ends, and localize to telomeres. We also show that suppressors with morphogenetic defects in genitalia (SMG) proteins, which are effectors of nonsense-mediated messenger RNA decay, are enriched at telomeres in vivo, negatively regulate TERRA association with chromatin, and protect chromosome ends from telomere loss. Thus, telomeres are actively transcribed into TERRA, and SMG factors represent a molecular link between TERRA regulation and the maintenance of telomere integrity. Science Nov 2;318(5851): Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends.

Accanto al telomero Associate al telomero sono inoltre presenti kilobasi addizionali di ripetizioni, che si dispongono tra il telomero ed il resto del cromosoma.

Chromosomal rearrangements involving the ends of chromosomes have emerged as an important cause of genetic disease given the gene-rich nature of the regions adjacent to the telomeres. The importance of such subtelomeric chromosome rearrangements has been clearly shown by their observed association with unexplained mental retardation and congenital abnormalities. Individual subtelomere specific probes have been used to focus on particular subtelomeric regions and have resulted in the establishment of new syndromes such as the chromosome 1p36 deletion syndrome and the 22q13.3 deletion syndrome. Sequenze associate al telomero

I telomeri dei mammiferi sono trascritti in RNA contenenti ripetizioni telomeriche (TERRA). Le molecole TERRA sono eterogenee in lunghezza, sono trascritte da diversi loci sub-telomerici verso le estremità dei cromosomi; si trovano localizzate nei telomeri; Parte delle ripetizioni telomeriche (TTAGGG) sono trascritte in un lungo RNA non codificante, chiamato TERRA (dalle porzioni acetilate aperte del DNA telomerico), che producono una sequenza di RNA con ripetizioni UUAGGG. L'estremità 3 'di questo lungo RNA non codificante è complementare alla sequenza del template dell’RNA contenuto nella telomerasi (hTR). Di conseguenza, TERRA funziona da inibitore diretto della telomerasi. Inoltre, questo TERRA contatta la subunità proteica della trascrittasi inversa della telomerasi (TERT) indipendentemente da hTR. La marcatura di due istoni sembra associata con la trascrizione di TERRA: 1) H3BK5-methylation 2) H3K4 -trimethylation possibili segnali di trascrizione attiva di TERRA

Regulation of telomere movement by telomere chromatin structure T. K. Pandita*, C. R. Hunt, G. G. Sharma and Q. Yang Cell. Mol. Life Sci. (2007) 64: 131–138 Abstract. Beyond their role in replication and chromosome end capping, telomeres are also thought to function in meiotic chromosome pairing, meiotic and mitotic chromosome segregation as well as in nuclear organization. Observations in both somatic and meiotic cells suggest that the positioning of telomeres within the nucleus is highly specific and believed to be dependent mainly on telomere interactions with the nuclear envelope either directly or through chromatin interacting proteins. Although little is known about the mechanism of telomere clustering, some studies show that it is an active process. Recent data have suggested a regulatory role for telomere chromatin structure in telomere movement. This review will summarize recent studies on telomere interactions with the nuclear matrix, telomere chromatin structure and factors that modify telomere chromatin structure as related to regulation of telomere movement.