IDENTIFICAZIONE DI UN’ATTIVITÀ ENZIMATICA SU GEL DI POLIACRILAMMIDE E DETERMINAZIONE DELLA TEMPERATURA OTTIMALE DI UN ENZIMA

Produzione di grandi quantità di proteine: Determinazione della struttura 3D. Enzimologia. Produzione di anticorpi. Usi terapeutici e commerciali Biologia cellulare; Prodotti di interesse industriale; Farmaci e terapia genica; Perchè produrre proteine ricombinanti? Clonaggio del cDNA eucariotico o del DNA procariotico in un vettore di espressione. Trasfezione/trasformazione in un’opportuna cellula/organismo ospite. Crescita dell’ospite. Raccolta delle cellule. Caratterizzazione del prodotto. purificazione della proteina di interesse. saggi biologici e studi di localizzazione. Come produrre proteine ricombinanti?

Espressione: produrre una proteina codificata da uno specifico gene In qualsiasi sistema di espressione Clonare il gene in un vettore di espressione. Trasformazione dell’organismo ospite. Selezione dei trasformanti. Produzione delle proteine (es. fermentazione, colture cellulari). Tutti i vettori che permettono alta espressione contengono: - Elementi Regolatori per controllare la trascrizione e la traduzione. - Siti di taglio di endonucleasi di restrizione. - Una regione che codifica per le funzioni di replicazione del vettore. - Un marker di selezione per mantenerela pressione selettiva sulle cellule che contengono il plasmide.

Ospiti: Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Baculovirus Cellule di mammifero in coltura Animali transgenici (moscerino, topo) Sistemi specializzati: oociti di Xenopus La scelta di un sistema dipende da: Resa. Purificazione del prodotto. Modifiche post-traduzionali. Manipolazioni genetiche del gene/cDNA. Costo. Difficoltà sperimentale. Sistemi di espressione

Vantaggi: Resa molto elevata (fino a 500 mg/l di coltura). Poco dispendioso, tecnologia abbastanza semplice. Sistemi di espressione ben conosciuti. Svantaggi: Assenza di modifiche post-traduzionali (glicosilazione, acetilazione, co-fattori etc.). Dimensione del cDNA clonabile piccola (15 kbp). Differenze nel “codon usage”. Sistema di espressione E. coli

Espressione in E. coli gram negativo Crescita veloce e alta densità cellulare Genetica ben conosciuta Alta disponibilità di vettori e ceppi mutati nessuna garanzia di produrre una proteina ricombinante biologicamente attiva. Sforzi continui per migliorare questo sistema di espressione Proteine di fusione e tags Originariamente per rendere la purificazione più semplice (cromatografia per affinità) Alcuni partners di fusione facilitano il folding Partners di fusione – maltose binding protein – glutathione S-transferase (GST) – DsbA and DsbC – tioredossina

C C H OH H H H H C C H O H H H NAD + NADH + H + EtanoloAcetaldeide (Alcool primario) pH 8.0 pH 7.0 ossidazione L’ADH catalizza l’ossidazione di diversi alcoli primari (gli alcoli secondari e terziari non sono buoni substrati) in presenza del coenzima piridinico NAD +, con un pH ottimale intorno ad 8,0; nella reazione inversa, numerose aldeidi sono ridotte in presenza di NADH, con un pH ottimale intorno alla neutralità.

148 kDa 37 kDa L’ADH è un metalloenzima che contiene atomi di zinco (1 per subunità) che partecipano all’evento catalitico e stabilizzano la struttura quaternaria della proteina. Quattro residui di cisteina (1 per sito attivo) sono essenziali per la catalisi. punto isoelettrico 4.9 L’alcool deidrogenasi di Bacillus stearothermophilus (ADH) Zn 2+

Strutture dell’alcool deidrogenasi

L’alcool deidrogenasi è stata prodotta per via ricombinante nel vettore di espressione procariotico pTrC99A. Caratteristiche del plasmide: origine di replicazione; marker di selezione (amp); sito di policlonaggio (MCS); lacZ blu-bianco screening; promotore e terminatore per l’espressione trc; La sequenza codificante deve essere inserita nel corretto codice di lettura. Attraverso mutagenesi sito- specifica è stata prodotta una versione mutagenizzata del gene che a livello proteico porta alla sostituzione amminoacidica di carica Glu11Lys. Promotore trc Nco I pTrc99A 4176 cb Polilinker lac I Origine pBR322 Amp Origine F1 Pst I gene adh

Produzione dell’alcool deidrogenasi wild type e mutante in Escherichia coli Piastraggio di E.coli su terreno LB contenente ampicillina Trasformazione di cellule competenti di E.coli con i plasmidi ricombinanti Raccolta delle cellule e preparazione degli estratti cellulari Inoculo e induzione con IPTG ADH E.coli pTrcADH E.coli

Negli estratti di Escherichia coli trasformati con uno dei due plasmidi è possibile rivelare l’attività dell’alcool deidrogenasi eterologa mediante un dosaggio specifico effettuato ad alta temperatura. Siccome le due proteine (wild-type e mutata) differiscono soltanto per una sostituzione di carica (Glu-Lys) esse possono essere discriminate mediante elettroforesi su gel nativo e colorazione per zimografia.

migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un campo elettrico Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabili che, ad un certo valore di pH, sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche Sotto l’influenza di un campo elettrico queste molecole cariche migrano verso il catodo o l’anodo, a seconda che possiedano una carica positiva (cationi) o negativa (anioni) ELETTROFORESI

Elettroforesi Velocità di Migrazione Direttamente proporzionale alla CARICA NETTA Inversamente proporzionale alla GRANDEZZA catodo anodo

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) sottoposte ad un campo elettrico le proteine migreranno verso l’elettrodo di carica opposta Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nell’intervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pI<8 ELETTROFORESI DI PROTEINE

Copolimerizzazione dei monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N’-metilene bisacrilammide (bis-acrilammide) La bis-acrilammide, composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene, è utilizzata come agente in grado di formare legami crociati I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda e occasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammide In tal modo nella catena è introdotto un secondo sito per l’estensione formazione di una matrice con legami crociati a struttura ben definita Acrilammide Bis-acrilammide POLIMERIZZAZIONE

GEL di POLIACRILAMMIDE (molto idrofilico => Trattiene grosse quantità di acqua) Acrilammidemetilenbisacrilammide + TEMED (iniziatore) estere disolfato di H 2 O 2, (estere disolfato di H 2 O 2, catalizzatore) Catalisi radicalica

mezzo di supporto utilizzato per l’elettroforesi di proteine e acidi nucleici L’acrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel La porosità del gel di poliacrilammide può essere regolata variando la percentuale di acrilammide e/o il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammide ACRILAMMIDE

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecole proteiche è l’elettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) L’SDS-PAGE consente la separazione di molecole con un rapporto carica/massa identico, ma di dimensioni molecolari diverse Nell’SDS-PAGE la matrice del gel è una sostanza reticolata che agisce come un setaccio, in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilità elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensioni

proteina Sodio Dodecil Solfato CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 OSO 3 - Na +

Gel di poliacrilammide

Nella SDS-PAGE la velocità di migrazione è inversamente proporzionale alle dimensioni della proteina (il rapporto CARICA/MASSA è uguale per tutte le proteine) - +

Gel Separatore (Resolving) pH 8.8 Dal 12% al 18% di Acrilammide Gel Impaccatore (Stacking) pH 6.8 (6% di Acrilammide)

Xilene cianolo Blu di bromofenolo

Xilene cianolo Blu di bromofenolo

Al termine dell’elettroforesi le proteine possono essere rivelate mediante colorazione. Tutte le proteine possono essere colorate con il Blue di Coomassie che si lega ai gruppi peptidici delle proteine. la colorazione di attività, o zimografia, sfrutta invece l’attività biologica della proteina.

Al termine della corsa elettroforetica il gel è colorato con una soluzione contenente acido acetico e blu di coomassie L’eccesso di colorante viene eliminato decolorando il gel con una soluzione di etanolo-acido acetico

Applicazioni dell’SDS-PAGE  Analisi quantitativa delle proteine presenti nella frazione di interesse  Identificazione del P.M. di proteine sconosciute  Analisi qualitativa delle proteine presenti nella frazione di interesse (colorazione con Blu Coomassie o western blotting)

Proteina di interesse 10 μg di proteine totali del campione da:

Analisi qualitativa e quantitativa di un SDS-PAGE 0,5µg 2,5 µg 1.STD 2.Omogenato 5 µl 3.I purif. 10 µl 4.II purif. 15 µl 5.III purif. 20 µl Alternativa: densitometria a scansione

Identificazione del PM di una proteina sconosciuta Log PM (Da) mobilità relativa (mm)

C C H OH H H H H C C H O H H H NAD + NADH + H + EtanoloAcetaldeide (Alcool primario) pH 8.0 pH 7.0 ossidazione L’ADH catalizza l’ossidazione di diversi alcoli primari (gli alcoli secondari e terziari non sono buoni substrati) in presenza del coenzima piridinico NAD +, con un pH ottimale intorno ad 8,0; nella reazione inversa, numerose aldeidi sono ridotte in presenza di NADH, con un pH ottimale intorno alla neutralità. Dosaggio di attività enzimatica

Esempio di zimografia per analizzare l’espressione di alcool deidrogenasi in E.coli : controllo negativo 2,3 : ADHmut in E.coli 4,5: ADHwt in E.coli - +

NADH A=  c l 340nm  mM (NADH) = 6,2 mM -1 cm -1 A340 nm Tempo (min) 2  L ADH 4  L ADH 10,5 0

Dosaggi di attività enzimatica a differenti temperature La miscela di reazione è costituita da una soluzione contenente: 2 mM NAD, 30 mM etanolo, tampone 25 mM sodio fosfato pH 8. Etanolo + NAD > Acetaldeide + NADH + H+ Dividendo l’incremento di assorbanza a 340 nm al minuto (  A/min) per il coefficiente di estinzione millimolare del NADH (6,2 O.D.), ovvero applicando la legge di Lambert e Beer, si calcolano le micromoli di NAD ridotto in 1 ml di miscela di reazione (le Unità Enzimatiche). Tenendo conto dei microlitri utilizzati per il dosaggio, si calcolano le Unità/ml di soluzione enzimatica. Il dosaggio è effettuato a differenti temperature e al termine si riporta in grafico l’attività enzimatica in funzione della temperatura.

Grafico termofilia Temperatura Unità enzimatiche