La prima dimensione : Isoelectric focusing (IEF)

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1 La prima dimensione : Isoelectric focusing (IEF)
v=E·z·f-1 v = velocità di migrazione della proteina in un campo elettrico E = forza del campo elettrico z = carica netta della proteina f = coefficiente frizionale = 6r  = viscosità del mezzo Sample preparation First dimension Second dimension Detection Image Analysis MALDI-TOF MS ESI MS/MS Tot 76 kVh 3500 V + anodo - catodo step1 proteine acide proteine basiche pH10 pH3 - step2 + - step3 + pI, punto isoelettrico  Z=Ø  v= Ø Parma , 8 Novembre 2001

2 I° dimensione : l’importanza
Sample preparation First dimension Second dimension Detection Image Analysis MS analysis La I° dimensione : IPG strips Immobilized PH Gradient strip = IPG strip Una I° dimensione eccellente assicura che gli spots (peptidi) siano ben separati (= risolti) nella II° dimensione, anche quando una grande quantità di proteine viene analizzata Perché la I° dimensione è così importante nella 2-DE ? Perché le IPG strips sono così importanti nella I° dimensione ? il gradiente di pH immobilizzato è stabile ed evita il fenomento della “catodic drift” ; se sono noti i valori di pI delle proteine d’interesse, l’intervallo di separazione IEF viene ristretto e ne consegue un’analisi estremamente mirata (>accuratezza e precisione) ; elevata risoluzione proteica ; alta riproducibilità dei risultati ; le proteine estremamente acide o basiche sono più facilmente separabili ; IPG buffers con stesso intervallo di pH delle IPG strips sono disponibili e il loro utilizzo fa notevolmente ridurre o elimina il background nella colorazione del gel …. I° dimensione : l’importanza Parma , 8 Novembre 2001

3 Sodio dodecil solfato (SDS)
La seconda dimensione : 2D SDS-PAGE Nella II° dimensione in condizioni denaturanti (“elettroforesi monodimensionale SDS-PAGE”) le proteine sono separate in un gel di poliacrilamide in base alla loro massa molecolare (MM) La miscela proteica è sottoposta a : 1. H3C-(CH2)10-CH2OSO3-Na+ Sodio dodecil solfato (SDS) = detergente anionico che spezza tutte le interazioni non covalenti delle proteine native + Mercaptoetanolo e ditiotreitolo = riducono i ponti disolfuro Gli anioni dell’SDS si legano alle catene principali in un rapporto di : ~ 1 molecola SDS • 2 residui di amminoacidi 2.  I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa  MM proteica 3. Sottoposte ad un C.E. le proteine migrano dal catodo- all’anodo+ in base alla loro MM I° dimensione : l’importanza Parma , 8 Novembre 2001

4 45 mA La seconda dimensione : 2D SDS-PAGE - CATODO + + ANODO IPG strip
Gel di poliacrilamide

5 Ettan DALT II System (APB)
Sistemi di analisi 2DE - strumenti Multiphor II (APB) I° DIMENSIONE (IEF) : 12 IPG strips / corsa II° DIMENSIONE (2D-PAGE) : Hoefer DALT unit (APB) 10 gels / ore IPG Phor (APB) 12 IPG strips / corsa Ettan DALT II System (APB) 12 gels / 4-6 ore t Giorno 1 16.00 13.00 Equilibrazione 9.30 Giorno 2 Reidratazione o.n. Separazione IEF 12.00 Giorno 3 Preparazione 2°dimensione Preparazione 2° dimensione (GELS) 17.00 Separazione 2D-PAGE Preparazione 2° dimensione Giorno 4 Giorno 5 Fissazione e colorazione Analisi 2DE : le apparecchiature Parma , 8 Novembre 2001

6 Vantaggi 2DE : vantaggi vs svantaggi
Grande capacità di separazione e risoluzione di miscele proteiche (2.000–3.000 proteine) Riproducibiltà e affidabilità dei risultati Possibilità di confronto dei dati tra laboratori differenti Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle proteine fosforilazione glicosilazione, tagli proteolitici, Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di riferimento disponibili in rete Identificazione MIRATA di uno specifico pattern proteico cellulare Parma , 8 Novembre 2001 Vantaggi vs vantaggi

7 Svantaggi 2DE : vantaggi vs svantaggi metodica lunga
molto dispendiosa in termini di : tempo, costo, fatica fisica bassa capacità di risoluzione delle proteine idrofobiche difficile separazione delle proteine molto acide o basiche scarsa risoluzione di proteine con MM > 150 kDa bassa risoluzione delle proteine poco rappresentative nel campione proteico mancanza di linearità o sensibilità tra abbondanza della proteina nel campione proteico e capacità di risoluzione tramite colorazione sul gel Vantaggi vs Svantaggi Parma , 8 Novembre 2001