Diagnostica microbiologica molecolare

Acidi nucleici

Acidi nucleici La coppia CG ha 3 legami idrogeno rispetto alla coppia AT che ne ha 2 La stabilità di una molecola di DNA è direttamente correlata alla frequenza di CG ed alla lunghezza dell’elica di DNA La stabilità dell’interazione tra filamenti è misurata attraverso la temperatura necessaria a rompere tutti i legami idrogeno (temperatura di melting)

MICROBIOLOGIA CLINICA MOLECOLARE IMPIEGO DI TECNICHE MOLECOLARI a fini diagnostici servono per identificare E/O caratterizzare in UN ISOLATO CLINICO UN PATOGENO sfruttando le caratteristiche degli acidi nucleici

MICROBIOLOGIA CLINICA MOLECOLARE METODICHE DI IBRIDAZIONE prevedono l’utilizzo di sonde per identificare e caratterizzare un bersaglio specifico IN VITRO, IN VIVO AMPLIFICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI PCR, PCR-DGGE, RT-PCR, PCR REAL TIME

Estrazione degli acidi nucleici Per l’estrazione degli acidi nucleici si utilizzano differenti tecniche in base all’efficienza e facilità di estrazione Separazione con solventi organici Separazione per affinità Separazione per scambio ionico Separazione per bollitura

Metodiche di ibridazione Generalmente viene scelta una corta sequenza di DNA a singolo filamento (sonda o probe) che ibrida una sequenza bersaglio complementare I saggi che utilizzano le sonde genetiche non sono limitate alle ibridazioni DNA-DNA ma anche DNA- RNA e RNA-RNA Le procedure diagnostiche che prevedono l’utilizzo di sonde sono più facilmente utilizzabili rispetto a quelle di amplificazione anche se la sensibilità è inferiore . Le infezioni più idonee per essere diagnosticate con queste tecniche sono quelle in cui i patogeni sono difficili da coltivare.

Metodiche a sonda di Dna Si dividono in tre categorie : 1. Ibridazione in fase solida, 2. Ibridazione in fase liquida, 3. Ibridazione in situ

Ibridazione in fase solida Ibridazione su filtro 1. Il Dna cromosomico o plasmidico è denaturato ed immobilizzato su filtro 2. La sonda (DNA a singolo filamento marcato con digossigenina) viene fatta reagire con il DNA presente sul filtro 3. Se sono presenti sequenze omologhe ibridizza 4. L’ibridizzazione si rivela con un test appropriato utilizzando un anticorpo anti digossigenina marcato con la fosfatasi alcalina

Ibridazione in fase solida Degli 8 campioni saggiati solo 3 sono positivi

IBRIDAZIONE SLOT-BLOT, COLONY-BLOT ADSORBIMENTO DENATUR SU FILTRO IBRIDAZIONE RIVELAZIONE SU SONDA LASTRA MARCATA SOSPENSIONE CELLULE O DNA CEPPI ISOLATI

Ibridazione in fase liquida In questo caso sia l’acido nucleico bersaglio sia la sonda sono risospesi in una soluzione acquosa La rivelazione avverrà mediante analisi elettroforetica su gel di agarosio

IBRIDAZIONE IN FASE LIQUIDA Figura 5.30 ESTRAZIONE DNA TOTALE DAL CAMPIONE DENATURAZIONE DEL DNA IBRIDAZIONE CON SONDA SPECIFICA DIGESTIONE CON NUCLEASI S 1 MONOCATENARIO ANALISI ELETTROFORETICA 1 2 3 4 1= MW MARKER 2=CAMPIONE NEGATIVO 3=CAMPIONE POSITIVO 4=DNA CONTROLLO

Ibridazione in situ È un tipo particolare di ibridazione in cui viene conservata la morfologia delle cellule o del tessuto da analizzare Viene utilizzata in particolare per analizzare tessuti I limiti sono la difficoltà delle sonde a penetrare all’interno dei tessuti più sono piccole più è facile, Le sonde sono marcate con la FISH (Fluorescent in situ Hybridation)

Ibridazione in situ FISH (Fluorescent In situ Hybridization) 2 cellule macrofagiche infettate da C. pneumoniae trattata con sonda per l’ RNA 16S del batterio. La sonda è marcata con fluorocromo Cy3 che dà un segnale rosso.

Ibridazione in situ Epatociti di hamster infettato con C. pneumoniae. In questo caso la sonda è marcata con 5.6 carbossifluorescina che dà un segnale verde

Amplificazione del segnale di ibridazione In questo caso si cerca di amplificare il segnale generato dalla sonda ibridata L’amplificazione del segnale di ibridazione ha il vantaggio di non coinvolgere né l’acido nucleico né la sonda evitando possibili contaminazioni

Metodiche di amplificazione del segnale di ibridazione Branched DNA, utilizza come bersaglio gli acidi nucleici che vengono estratti e catturati mediante ibridazione con diverse sonde a cui segue ulteriori ibridazioni Hybrid capture, Utilizzato per alcuni virus dopo l’estrazione del genoma si effettua una ibridazione con RNA. L’ibrido DNA/RNA è rilevato aggiungendo anticorpi specifici marcati con fosfatasi

Amplificazione del segnale di ibridazione secondo il sistema Branched DNA Non c’è estrazione del genoma virale ma si procede con una lisi del virus Il genoma rilasciato è catturato e fissato su pozzetti mediante ibridazione con delle sonde “capture probes” e “extender probes” Queste si ibridizzano a loro volta con sonde di preamplificazione che a loro volta si legano a sonde di amplificazione a pettine Sonde con fosfatasi alcalina si legano alle sonde di DNA a pettine ,e in seguito l’aggiunta di un substrato si legge la reazione chemioluminescente

Amplificazione del segnale di ibridazione secondo il sistema Branched DNA

Hibrid capture Estrazione del genoma virale, ibridazione in fase liquida con sonda a RNA , l’ibrido è catturato su un supporto solido mediante un anticorpo specifico, i frammenti DNA-RNA vengono rilevati con altri anticorpi marcati con fosfatasi che legano i siti liberi degli ibridi

Metodiche di amplificazione degli acidi nucleici Le metodiche più utilizzate ai fini diagnostici sono: PCR (Polymerase Chain Reaction) TMA (Transcription Mediated Amplification) NASBA (Nucleic acid Sequence-Based amplification)

PCR (Polymerase Chain Reaction) Metodo con cui una sequenza di acido nucleico viene amplificata esponenzialmente in vitro. Può essere usata anche per modificare la sequenza amplificata o per aggiungere nuova informazione di sequenza. Le estremità della sequenza da amplificare devono essere note, per sintetizzare degli oligonucleotidi che saranno ibridizzati ad esse, per dare inizio alla reazione. Non è necessario che la sequenza sia inizialmente presente in forma pura. La sequenza da sintetizzare può essere presente inizialmente come una molecola discreta oppure può essere parte di una molecola più grande. In entrambi i casi, il prodotto della reazione sarà una molecola discreta di dsDNA con estremità corrispondenti a quelle 5’ degli oligomeri utilizzati.

Altre metodiche di amplificazione degli acidi nucleici TMA (Transcription Mediated Amplification) è un metodo di amplificazione dell’RNA bersaglio che utilizza la transcriptasi inversa e la T7 polimerasi e due primer

Schema operativo TMA La metodica è autocatalitica avviene a 41,5 °C, prevede una incubazione a 60°C, per permettere l’ibridazione del primer, se l’acido nucleico è il DNA la temperatura di denaturazione è 95-100°C

Metodica NSBA (Nucleic acid Sequence-Based amplification) Si differenzia dalla precedente solo per la assenza di attività RNAasica della transciptasi inversa . In questo caso è necessario anche aggiungere un terzo enzima RNAasi H per far avvenire la reazione

Vantaggi delle metodiche descritte 1. Rapidità di esecuzione 2. Tutte le fasi avvengono in un’unica provetta e senza lavaggi 3. Il prodotto di amplificazione è costituito da RNA meno resistente alla degradazione rispetto al DNA ottenuto alla fine della PCR

Rivelazione post amplificazione Esistono differenti metodi di rivelazione: 1. Elettroforesi su gel di agarosio 2. Cattura del prodotto di amplificazione 3. Rivelazione mediante test di protezione dell’ibridazione (HPA)

1. Elettroforesi su gel di agarosio

2. Cattura del prodotto di amplificazione Si utilizzano sonde adese su piastre a 96 pozzetti o a biglie magnetiche Durante la fase di amplificazione i primer in posizione 5’ si legano ad un enzima la biotina Si aggiunge un substrato e si legge la reazione colorimetrica

3. Rivelazione mediante test di protezione dell’ibridazione (HPA) HPA (Hybridation Protection Assay) Ibridazione dell’amplificato con sonde chemioluminescenti a singola elica complementari marcate con estere di acridinio (AE) Lettura con un luminometro

HPA (Hybridation Protection Assay)