Determinazione dei microrganismi negli alimenti Argomenti e obbietivi Necessità e problematiche nella determinazione dei microrganismi negli alimenti Metodologie alternative Principi - vantaggi e svantaggi – applicazioni in ambito alimentare 531

Tecniche di biologia molecolare (PCR [±], coltura –dipendenti/-indipendenti) Tecniche immunologiche Tecniche basate su proprietà fisiologiche 532

Obbietivo Rilevazione Numerazione (quantificazione) Identificazione (tipizzazione) Monitoraggio (di specie o ceppi) 533

Strategia scelta in base a: Tipo di alimento Microrganismo o gruppo microbico ricercato (ruolo) Scopo dell’analisi 534

Necessità - Richieste Accuratezza/Precisione Tempo Livello d’informazione Automatizzazione Costo Personale addestrato 535

Da considerare ancora: Difficoltà nella determinazione di microrganismi d’interesse alimentare: -microrganismi difficili da coltivare su terreni di coltura (es. Campylobacter jejuni, virus) - microrganismi con danni subletali o vitali non coltivabili (VBNC) 536

- Approcci di determinazione dei microrganismi che bypassano fasi di coltivazione - Coltura - indipendenti o diretti - Utilizzano tecniche di biologia molecolare e analizzano il DNA (o RNA) dei microrganismi estratto direttamente dal campione Oltre alla microbiologia “classica”: 537

Analisi tradizionaleAnalisi diretta Campione di alimento Arricchimento Terreni selettivi/differenziali Isolamento di colonie sospette ID tradizionaleID molecolare Estrazione di acidi nucleici Analisi DNA- rilevazione Analisi RNA-attività vitalitàvirulenza 538

539 DNA: molecola stabile RNA: molecola che viene degradata rapidamente Persiste anche dopo la morte cellulare Degradazione con la morte cellulare RNA (mRNA, rRNA): indicatore di vitalità

Metodi basati sulla biologia molecolare 540 Biologia molecolare: sviluppata negli ultimi anni, in seguito alle scoperte relative al materiale ereditario delle cellule e dei meccanismi di trasmissione delle informazioni genetiche Metodi basati sull’analisi delle macromolecole delle cellule, soprattutto degli acidi nucleici Ampia applicazione delle metodiche di biologia molecolare con l’invenzione della PCR PCR la base per diversi approcci diagnostici in ambito della microbiologia degli alimenti

541 Griffith, 1928 Mendel, Watson and Crick, Kary Mullis, Inheritance of phenotypic traits Structure of DNA DNA, hereditary material Molecular cloning PCR Sequencing Haemophilus influenzae Human Genome Sequencing Pietre miliari biologia molecolare

Modello Watson-Crick, Struttura tridimensionale del DNA Replicazione del DNA e trasferimento dell’informazione genetica

Struttura di nucleotide 543

Basi azotate 544

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Polarità 546

Filamenti anti-paralleli Direzione 547

Complementarità 548

Meccanismo di replicazione 549

Replicazione semi-conservativa 550

PCR Polymerase Chain Reaction (Reazione a catena della Polimerasi) Metodo di sintesi enzimatica in vitro di sequenze specifiche di DNA 551

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Fasi della reazione a catena della polimerasi Denaturazione Annealing dei primers Estensione 553

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Miscela di reazione Tampone di reazione (Tris-HCl 10 mM pH 8.4, 50 mM KCl) MgCl mM o maggiore dNTPs mM Primers mM Polimerasi UI / 50 μl rxn Target DNA 1 ng - 1  g 565

566 Reazione PCR Thermal cycler (termociclatore)

Primer Design Lunghezza: bp Estremità 3’ importante (contenuto in G/C) Contenuto in G+C: % Temperatura di ‘melting’ simile tra i due primers Evitare sequenze ripetitive Evitare complementarità all’interno o tra i primers 567

Ottimizzazione della PCR Due parametri principali da ottimizzare: Temperatura di annealing Concentrazione di MgCl 2 Specificità (condizioni che permettono l’amplificazione solo del target DNA) Efficienza (quantità di prodotto PCR, rilevazione) 568

La rilevazione dei prodotti PCR solitamente avviene attraverso elettroforesi in gel d’agarosio 569

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Primers La tipologia dei primers varia a seconda dello scopo della PCR per esempio:Primers specie-specifici Primers genere-specifici Primers ‘universali’ ‘Random’ primers La scelta dei primers è essenziale per la PCR (specificità ed efficienza) Ottimizzazione 573

574 Applicazioni della PCR in microbiologia degli alimenti Applicazione coltura-dipendente: su colonie precedentemente isolate da matrici alimentari per: - identificazione a livello di specie (primers specie-specifici) - caratterizzazione molecolare di isolati (primers random) Applicazione coltura-indipendente: su DNA estratto direttamente da una matrice alimentare per la rilevazione di microrganismi (patogeni)

Pesatura Analisi microbiologica tradizionale Diluizione iniziale Omogeneizzazione Semina su terreni solidi Conta/Isolamento Identificazione/Conferma Incubazione 575 Applicazione PCR coltura dipendente per l’identificazione Applicazione PCR coltura indipendente per rilevazione

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Elettroforesi in gel d’agarosio di prodotti PCR multiplex (recA per lattobacilli) L. paraplantarum L. pentosus L. plantarum 577

578 Geni usati come caratteri diagnostici per l’attribuzione della specie Per microrganismi patogeni: geni che codificano per fattori di virulenza sono usati come caratteri diagnostici Prova PCR positiva: il microrganismo appartiene alla specie patogena o nell’alimento è presente il microrganismo patogeno

Applicazione coltura-indipendente – PCR specie specifica 579

Applicazione coltura-indipendente – PCR specie specifica 580

581 Applicazioni della PCR in microbiologia degli alimenti Vantaggi Notevole risparmio di tempo; tempi per la risposta ridotti (specialmente per patogeni) Identificazione inequivocabile Rilevazione di mo VNC (utilizzando RNA come target) Possibilità di distinguere rappresentanti di una specie

Problematiche relative all’applicazione della PCR per la rilevazione di patogeni negli alimenti Sostanze inibenti negli alimenti o nei terreni di coltura utilizzati Numero basso di cellule microbiche target Specificità Sensibilità 582

Possibili soluzioni Diluire l’alimento o il brodo colturale utilizzato al fine di diluire l’inibente Fasi di pre-arricchimento per incrementare il numero di cellule bersaglio Scegliere dei primers con target geni specifici del m.o ricercato Utilizzo di tecniche per la rivelazione dei prodotti PCR più sensibili del etidio bromuro in agarosio- concentrazione 583

qPCR Quantitative or Real Time PCR PCR quantitativa 584

585 qPCR Monitoraggio dell’andamento della reazione PCR in tempo reale Rilevamento dei prodotti PCR durante la reazione Utilizzo di fluorofori (che si associano ai prodotti PCR) Strumenti (termociclatori) che misurano la fluorescenza emessa in ogni ciclo della reazione

Fluorofori (fluorophores) 586

Emissione e detection della fluorescenza 587

qPCR Metodo rapido Contaminazione ? Metodo quantitativo 588

Principio qPCR 589

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Quantificazione 591 Retta di taratura (curva di calibrazione) Equazione: y=-αx+β x: concentrazione (ufc/g) del microrganismo y: valore C t

Chimica della qPCR Flurofori “generici” (intercalanti, SYBR Green) Sonde (oligonucleotidi) marcate con fluorofori 592

593 Applicazione della qPCR Quantificazione di microrganismi direttamente in campioni d’interesse alimentare Patogeni tecnologici (monitoraggio di fermentazioni) alteranti Vantaggi della PCR tradizionale Quantificazione

594 Considerazioni retta di taratura specifica per: microrganismo e alimento importante: qualità di DNA (o RNA) estratto dall’alimento; ottimizzazione comparazione di risultati DNA/RNA/conta per valutare lo stato delle cellule del microrganismo ricercato