NEI SOLI USA CI SONO DA 6 A 80 MILIONI DI PERSONE OGNI ANNO COLPITI DA MALATTIE DI ORIGINE ALIMENTARE CON DECESSI ED UN COSTO SOCIALE DI CIRCA 5 MILIARDI DI DOLLARI

LO STUDIO DELLA MICROBIOLOGIA ALIMENTARE  Provenienza e significato delle varie specie microbiche presenti  Comportamento microbico durante i processi tecnologici  Influenza durante la conservazione  Particolari gruppi microbici che determinano l’insorgenza di malattie

INFORMAZIONI RICAVATE DALLA MICROBIOLOGIA ALIMENTARE MICROBIOLOGIA ALIMENTARE Stabilire le fonti di contaminazione Valutare il rispetto delle norme igieniche Valutare le condizioni di conservazione Seguire l’esatto susseguirsi di certi processi industriali Eliminare del commercio i prodotti contaminati

ESAME BATTERIOLOGICO DEGLI ALIMENTI Obiettivo primario: assicurare la tutela della salute del consumatore cioè dimostrare l’assenza di germi patogeni Limiti distribuzione non omogenea dei batteri patogeni nel prodotto presenza di germi patogeni in basse concentrazioni presenza di agenti patogeni non batterici Questi limiti si possono in parte risolvere con: La ricerca di germi indice di contaminazione. Requisiti di un germe indice di contaminazione: avere la stessa nicchia ecologica del patogeno; avere la stessa modalità di trasmissione del patogeno; essere presente in numero elevato; essere facilmente rilevabile. Germi indice di contaminazione fecale 1) Coliformi 2) Enterococchi 3) Clostridi solfito-riduttori

Il “nostro” laboratorio batteriologico…

Fattori che possono incidere sui risultati delle analisi microbiologiche:  la preparazione specifica, l’esperienza e l’interesse dell’analista  l’idoneità delle apparecchiature ed il loro stato di manutenzione  l’accuratezza di preparazione dei terreni di coltura e la qualità dei loro componenti

Qualsiasi schema di analisi, anche se completo, dettagliato e ben eseguito, ha bisogno di un razionale criterio di campionamento. Questo perché i risultati ottenuti, dall’esame di una sua aliquota, dovranno essere estrapolati ad un intero lotto o partita di alimento.

CAMPIONAMENTO a) Unità campionarie (o di campionamento = u.c.): singola aliquota o confezione di alimento, scelta casualmente e sulla quale si eseguiranno le opportune analisi; b) Lotto (o partita): con questo termine si intende, per convenzione, una quantità di alimento prodotta e confezionata in condizioni uniformi entro un limitato periodo di tempo (per esempio: giornata lavorativa, turno di lavoro, ecc.). Risulta evidente che quanto meno uniformi sono le condizioni di produzione, tanto minore deve essere, ai fini di una maggiore omogeneità, il suddetto lasso di tempo preso in considerazione ai fini del campionamento; c) Campione rappresentativo: quello le cui condizioni di produzione si avvicinino, sotto il profilo quali-quantitativo quanto più possibile a quelle di tutto il lotto dal quale è stato prelevato; d) Campione casuale: insieme di unità campionarie selezionate da un lotto precedentemente definito, seguendo un procedimento che assicuri ad ogni unità la medesima probabilità di essere prelevato.

Piano di campionamento elaborato da I.C.M.F.S. (International Committee Microbiological Foods Standardization) I valori guida sono espressi dai seguenti simboli: m = indica il limite prefissato per una determinata caratteristica microbiologica dell’alimento in esame. (es.: i valori di carica microbica saprofitaria) M = indica valori superiori a quello sopra indicato, non eccedenti tuttavia un determinato livello. c = indica il numero di aliquote componenti il campione in esame nei quali è consentito il raggiungimento dei valori indicati da M. n = indica le aliquote di prodotto componenti il campione in esame.

Classificazione dei campioni in esame 1.ACCETTABILI: con valori inferiori ad “m”. 2. PARZIALMENTE ACCETTABILI: con valori compresi tra “m” e “M”. 3. INACCETTABILI: con valori superiori ad “M”. La severità di un piano di campionamento dipende direttamente dai valori che si attribuiscono ad “n” e “c”

Valori soglia [ oltre il quale possono insorgere tossinfezioni alimentari e malattie infettive ] AGENTE Livello soglia per popolaz. sana Salmonella <10 5 Tossina stafilococcica <1 mcg Clostridium perfrigens 10 6 Campylobacter Vibrio cholera 10 6 Shigella 10 1 – 10 2 H.A.V Yersinia 10 9 Norwalk virus 10

Terreno di coltura AGAR:   Estratto di alga rossa   Solidifica a 42°C   Non è digeribile Acqua Elementi nutrizionali Sostanze inibenti

Schema di controllo delle operazioni per la preparazione dei terreni di coltura

L’impiego di metodi analitici non idonei può comportare il conseguimento di falsi risultati sia negativi che positivi. I primi costituiscono un problema di salute pubblica; i secondi producono ingiustificati danni di natura economica e giuridica.

Tecnica delle membrane filtranti

Membrane filtranti ENUMERAZIONE BATTERICA SVANTAGGI Eccessiva selettività dei terreni ( e temperature) Interferenza da materiale in sospensione  ostruzione dei pori  può provocare un film di crescita Più batteri formanti una colonia (U.F.C.) Errori di laboratorio  bolle d’aria  terreno scarso  dischetti sommersi

Membrane filtranti VANTAGGI rapidità dei risultati (24/48 h) maggiore accuratezza e precisione riduzione dello spazio occupato < laboriosità di esecuzione esami di volume maggiori di acqua possibilità di rilevare la presenza di batteri diversi da quelli ricercati ENUMERAZIONE BATTERICA

Tecnica per inclusione

ENUMERAZIONE BATTERICA Formula di Poisson: X = numero di germi stimato per ml Ci = totali germi contati per ogni diluizione Ni = piastre per diluizione Zi = diluizione

C 1 = conte batteriche con maggior numero di CFU C 2 = conte batteriche con minor numero di CFU VALUTAZIONE DELL’ATTENDIBILITA’ DELLA CONTA SECONDO LE MEDIE DI POISSON

Prova presuntiva Prova conclusiva conferma + -

Indice MPN

ENUMERAZIONE BATTERICA Formula di Thomas per MPN P = numero di tubi positivi N = volume del campione nei tubi negativi T = volume totale del campione inoculato in tutti i tubi X = numero di germi per 100 ml

Tecnica MPN ENUMERAZIONE BATTERICA SVANTAGGI  Metodica lenta (48-96 h) e laboriosa  Procedimento costoso  Manca di precisione nei risultati  I risultati possono essere inficiati da fenomeni di interferenza dovuti alla presenza nel campione di: Flora microbica concorrente Elevata concentrazione di nitrati che inibisce l’attacco fermentativo dei coliformi agli zuccheri (EFFETTO ANAEROGENICO)

D. lgs. n° 31 del 2 febbraio 2001 Attuazione della direttiva 98/83 CE relativa alle acque destinate al consumo umano

ISO (International Standardisation Organisation – Ente Mondiale di Normazione) CEN (Comitato Europeo di Normazione – Ente Europeo di Normazione) UNI (Ente Italiano di Normazione) UNI EN ISO 9000 ha emesso fin dal 1987 una famiglia di standard (NORME) che definiscono le prescrizioni da adottare in azienda per realizzare un SISTEMA di QUALITA’: si tratta della famiglia di standard (ISO 9000) ha recepito le norme ISO come EN ISO In ITALIA le ha recepite come

Definizione del campo di applicazione Confronto con un metodo di riferimento produttività selettività riproducibilità

Allestimento colture batteriche miste con germi interferenti Diluizione della coltura di partenza fino a concentrazioni leggibili Analisi con il metodo di riferimento lettura Conferma biochimica Calcolo della sensibilità e della specificità Analisi con il metodo di prova lettura Conferma biochimica Calcolo della sensibilità e della specificità Verifica delle differenze di recupero mediante analisi della regressione lineare Confronto della specificità e sensibilità mediante il test  2

Il nuovo protocollo viene applicato a campioni sottoposti ad analisi routinarie accanto al metodo tradizionale, con conseguente verifica dei risultati. Il nuovo protocollo viene applicato a campioni sottoposti ad analisi routinarie accanto al metodo tradizionale, con conseguente verifica dei risultati. Il metodo di riferimento viene sostituito con quello alternativo qualora i risultati ne comprovino la superiorità o l’equivalenza. Tutta la documentazione viene archiviata.

Controllo microbiologico dell’aria e delle superfici degli ambienti di lavorazione Campionatore d’aria Piastre da contatto

I microrganismi gram + (cocchi e bastoncelli) più interessanti per la microbiologia degli alimenti fanno parte delle seguenti famiglie e generi: Cocchi: fam. Micrococcaceae Gen. Micrococcus Gen. Staphylococcus Bastoncelli Gram + sporigeni Bastoncelli Gram + regolari non sporigeni Gen. Streptococcus Gen. Pediococcus Gen. Leuconostoc Gen. Bacillus Gen. Clostridium Gen. Lactobacillus Gen. Listeria Gen. Erysipelotrix Gen. Brochotrix Bastoncelli Gram + irregolari non sporigeni Gen. Corynebacterium Gen. Arthrobacter Gen. Brevibacterium Gen. Microbacterium Gen. Propionibacterium Gen. Bifidobacterium Bastoncelli Gram + irregolari non sporigeni Fam. MicobacteriaceaeGen. Mycobacterium

I microrganismi gram – di maggior interesse alimentare sono inclusi nelle seguenti famiglie: Fam. PseudomodaceaeGen. Pseudomonas Gen. Xantomonas Gen. Acetobacter Gen. Gluconobacter Gen. Flavobacterium Gen. Alteromonas Gen. Alcaligenes Gen. Brucella Gen. Chromobacterium Gen. Moraxella Gen. Acinetobacter Fam. Neisseriaceae Fam. VibrionaceaeGen. Aeromonas Gen. Vibrio Fam. SpirillaceaeGen. Campylobacter Fam. EnterobacteriaceaeGen. Escherichia Gen. Enterobacter Gen. Hafnia Gen. Citrobacter Gen. Klebsiella Gen. Erwinia Gen. Serratia Gen. Edwarsiella Poiché fermentano il lattosio vengono chiamati coliformi Gen. Salmonella Gen. Shigella Gen. Proteus Gen. Providencia Gen. Yersinia Non fermentano il lattosio