Cromatografia Liquida ad Alta Pressione (HPLC) Viene descritta per la prima volta la cromatografia liquida-liquida Moore e Stein automatizzano l’analisi di amminoacidi usando la tecnica dello scambio ionico Hamilton riesce ad aumentare la velocità e la risoluzione nell’analisi automatica di amminoacidi. Viene introdotto il concetto di gradiente di eluizione con soluzioni saline. Viene introdotto l’uso di fasi con particelle di piccole dimensioni, colonne di piccolo diametro, compressione dell’eluente in testa alla colonna. Vengono definiti una varietà di parametri operativi e ottimizzate le condizioni per rendere possibili l’analisi di sostanze in quantità subnanomolare (Kirkland, Horvath, Brown, Burtis e Gere), vengono sviluppate nuove fasi con particelle di piccolo diametro Scambiatori anionici e cationici con superficie porosa (gruppo di Kirkland alla Du Pont) Scambiatori ionici di tipo pellicolare (Horvath e coll a Yale), Corasil e Porasil (Waters).

HPLC vs cromatografia convenzionale Sistema ad alta pressione Sistema convenzionale: percolamento per gravità Condizioni comuni ad entrambe le separazioni: Campione:0.5 mL di una soluzione di indofenolo di sodio e rosso di metile 0.5 mg/mL ciascuno in acqua/metanolo 85:15. Fase mobile: Acqua-metanolo 85:15 Fase stazionaria: gel di silice mesh per il sistema convenzionale, lo stesso materiale per il sistema ad alta pressione macinato e passato attraverso un setaccio a 325 mesh

Alta sensibilità (nell’intervallo nano-picomoli) Buone risoluzioni Versatilità Velocità di analisi Analisi qualitative e quantitative Il campione non viene distrutto e le frazioni possono essere raccolte Di norma non richiede derivatizzazione del campione Le colonne sono riutilizzabili Principali vantaggi HPLC Può essere applicata all’analisi di :  Nucleotidi, nucleosidi, basi o idrolizzati di DNA  Farmaci e loro metaboliti  Proteine, peptidi, amminoacidi  Lipidi, steroidi  Pesticidi  Vitamine  Alcaloidi  Antiossidanti  Plastificanti  Aromi

Diagramma a blocchi di un tipico sistema HPLC 1. Riserva di solvente 8. Misuratore di flusso 3.Pompe 5. Precolonna/colonna 6. Rivelatore 4. Iniettore 7. Registratore 9. Collettore di frazioni 10. Raccolta ed elaborazione dati 2. Sistema di gradiente

Sono requisiti fondamentali di un cromatografo liquido:  Massima resistenza alla corrosione;  resistenza ad alte pressioni di testa ( psi) ed elevati flussi (0.1 –100 mL/min);  connessioni, iniettore, rivelatore con volumi morti minimi;  velocità di flusso costante con precisione < 2%

La pompa Camma eccentrica Pistone Valvola Ingresso Valvola Uscita  Pompe a flusso pulsante con smorzatore di flusso  Pompe a due o più pistoniMateriali: Corpo della pompa  Acciaio inossidabile Pistone  zaffiro, rubino Corpo del cilindro  zaffiro, titanio o PEEK polietereterechetone) Tubi  PEEK o PTFE (politetrafluoroetilene, Teflon)

Iniettore Modalità introduzione campione sulla colonna Diretta con una siringa tarata Con valvole (di gran lunga il più utilizzato) Loop : 10  l a 2 mL Iniettore a due posizioni e sei entrate Due fasi Caricamento 1. Caricamento: il campione viene introdotto nel loop fino a riempimento totale o parziale. Iniezione 2. Iniezione: la rotazione di una valvola devia il flusso della fase mobile attraverso la camera del campione e lo trasporta sulla colonna

Rivelatori Universali: Universali: Rivelatore ad indice di rifrazione Rivelatore a calore di assorbimento Rivelatore a ionizzazione di fiamma Spettrometri di massa Selettivi: Selettivi:Rivelatori UV-Vis Rivelatori di fluorescenza Rivelatori elettrochimici Rivelatori a conduttività elettrolitica Rivelatori polarografici Specifici: Specifici:Rivelatori di radioattività Rivelatori chirali Caratteristiche dei più comuni rivelatori usati in HPLC Sensibilità assoluta Sensibilità assoluta (dipende dalla caratteristiche costruttive) E’ il valore minimo della grandezza misurata che determina la deflessione a fondo scala del registratore ad un dato valore del rumore. Sensibilità relativa E’ la minima concentrazione di soluto eluito che può essere distinto dal rumore (S/N=2)

Rivelatore ad indice di rifrazione Principio operativo L’indice di rifrazione di un solvente cambia in presenza di un soluto. I sistemi ottici utilizzati sono basati su due principi: 1. Principio della deviazione: il rivelatore (rifrattometro differenziale) risponde alla deviazione di un raggio di luce monocromatica causato dalla differenza di indice di rifrazione tra la soluzione presente nella cella del campione e quella della cella di riferimento. La deflessione angolare del raggio si riflette nella localizzazione del raggio piuttosto che nella sua intensità. In funzione della variazione di posizione del raggio sulla cella fotoelettrica si avrà una variazione nel segnale in uscita amplificata elettronicamente. 2. Principio della riflessione: l’intensità della componente riflessa di un raggio di luce monocromatica che colpisce la superfisce dell’effluente cambia inversamente con l’indice di rifrazione. Lampada a tungsteno Caratteristiche Universale Non distruttivo Sensibilità buona, ma non molto elevata Non si può utilizzare l’eluizione in gradiente Il controllo della temperatura dell’effluente della colonna e del rivelatore è critico

Rivelatore ad assorbimento UV/Vis-1  A lunghezza d’onda fissa (254/280 nm )  A lunghezza d’onda variabile (UV, UV-Vis)  A serie di diodi Sorgente Monocromatore Campione Sorgente Campione Elemento Serie di diodi Disperdente Caratteristiche Selettivo Non distruttivo Piccoli volumi morti Insensibile a variazioni nella velocità del flusso Buon intervallo di linearità Non richiede controllo della temperatura Può essere usato con eluizione in gradiente Sensibilità buona-elevata in dipendenza delle classi di composti. Lampade ad arco di deuterio (UV) Tungsteno (visibile) Fotomoltiplicatore

Possono essere effettuate derivatizzazioni per rendere rivelabili gruppi di composti. Es. determinazione formaldeide ed acetaldeide in fluidi biologici Rivelatore ad assorbimento UV/Vis-2 Sono rivelabili composti che presentano un cromoforo che ricade nella regione UV-Vis Reazione dell’acetaldeide con la 2,4-dinitrofenilidrazina a dare il 2,4-dinitrofenilidrazone

Rivelatore ad assorbimento UV/Vis-3 Assorbimento UV dei più comuni solventi Nella scelta della fase mobile bisogna considerare l’assorbimento nella regione di interesse analitico dei solventi utilizzati

Rivelatore di fluorescenza-1 Il fenomeno della fluorescenza Effetto degli equilibri soluto-solvente sull’energia degli stati elettronici

Rivelatore di fluorescenza-2 Lampade a xeno, vapori di mercurio ad alta pressione Caratteristiche Altamente selettivo Poco versatile Può essere usato con eluizione in gradiente Sensibilità molto elevata per l’analisi di composti in tracce. Permette l’analisi solo di composti che presentano fluorescenza o possono essere convertiti in derivati fluorescenti Es Analisi di amminoacidi dopo derivatizzazione (pre o post colonna) con aldeide o-ftalica

Rivelatore elettrochimico-1 Principio operativo Risponde a composti che siano ossidabili o riducibili. Il segnale si origina da un flusso di elettroni prodotto nelle reazioni che hanno luogo alla superficie dell’elettrodo. La reazione è molto rapida e lo strato in prossimità dell’elettrodo è continuamente privato del materiale che reagisce. Rivelazione amperometrica: è di gran lunga la più usata. Il potenziale dell’elettrodo di lavoro viene tenuto fisso e viene registrata la corrente derivante dall’ossidazione (riduzione) dell’analita. E’ richiesta una cella di elettrolisi ed un sistema di controllo potenziostato. Nella cella sono presenti tre elettrodi: l’elettrodo di lavoro, l’elettrodo ausiliiario (controlelettrodo) a cui avviene la reazione complementare e l’elettrodo di riferimento che compensa le variazioni di conduttività della fase mobile fornendo un potenziale stabile contro cui misurare il potenziale dell’elettrodo di lavoro. Il potenziostato regola il voltaggio in uscita finchè il segnale di potenziale e la differenza di potenziale dell’elettrodo di riferimento e di lavoro siano uguali

Rivelatore elettrochimico-2 Per un uso ottimale di un rivelatore elettrochimico è opportuno scegliere empiricamente il potenziale dell’elettrodo nelle condizioni di analisi (pH, solvente, forza ionica ) La conoscenza del potenziale standard dell’analita è una buona base di partenza voltammogramma Si registra una curva corrente di elettrolisi contro il potenziale dell’elettrodo di lavoro (voltammogramma) Miscela di tre componenti ossidabili Forma ridottaForma ossidata Forma ossidata + forma ridotta Curve corrente-voltaggio

Rivelatore di radioattività Rivelatori specifici Per la rivelazione di composti marcati con isotopi radioattivi L’effluente della colonna è messo in contatto con uno scintillatore. Gli impulsi luminosi generati vengono rivelati da un tubo fotomoltiplicatore. 1.Conta di scintillazione eterogenea: l’effluente passa in una cella o un tubo impaccato con uno scintillatore 2.Conta di scintillazione omogenea: l’effluente ed una soluzione dello scintillatore vengono fatti passare nella cella di misurazione. L’efficienza è superiore al metodo precedente Applicazioni: su composti marcati con 14 C o 3 H per lo studio di vie metaboliche, biotrasformazioni di farmaci e la determinazione di attività enzimatiche Rivelazione UV Rivelazione di radioattività

Rivelatore chirale  Un rivelatore chirale misura la rotazione ottica del contenuto della cella di analisi istante per istante.  Poiché il rivelatore risponde solo a composti otticamente attivi, il suo uso semplifica l’analisi di composti chirali in miscele organiche complesse. Esempio : analisi di antibiotici in tracce nel latte bovino E’ possibile rivelare selettivamente solo le gentamicine in presenza di una varietà di altri composti non otticamente attivi

Sistemi di interfaccia LC/MS Si utilizzano sorgenti ioniche operanti a pressione atmosferica Gli ioni già preformati vengono inviati mediante opportuni potenziali all’interno dello spettrometro di massa. Sorgente API Analizzatore Rivelatore LC – 10 –7 torr

ElectroSpray Ionization ESI La ionizzazione avviene per elettronebulizzazione: Gli ioni si formano da soluzioni che vengono finemente nebulizzate attraverso un capillare tenuto ad alto potenziale elettrico. La soluzione di analita passa attraverso un nebulizzatore dove incontra un flusso di gas (azoto) che circonda la soluzione 1. Nebulizzazione 2. Desolvatazione/evaporazione 3. Formazione di ioni Fasi del processo di ionizzazione ES : Per le forze di taglio generate dal gas e il campo elettrico presente (2-10 kV) si crea uno spray fine di goccioline cariche sulla superficie per azione dei campi elettrostatici. Un gas riscaldato porta all’evaporazione parziale del solvente. Le dimensioni delle goccioline diminuiscono mantenendo la stessa quantità di cariche. Quando la forza di Coulomb eguaglia la tensione superficiale le goccioline esplodono liberando gli ioni di analita.

Schema di una sorgente ESI

Il nostro strumento : Agilent 1100 LC/MSD Geometria ortogonale per minimizzare l’inquinamento della sorgente.

ESI + ESI -