MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI e SMISTAMENTO DELLE PROTEINE

Nelle cellule eucariotiche, un polipeptide può svolgere la sua funzione lontano dal sito di sintesi (es. organuli specifici, escrezione) Inoltre, i polipeptidi sono spesso modificati e tali modificazioni sono importanti al fine del significato funzionale dei polipeptidi stessi (es. fosforilazioni, glicosilazioni, proteolisi, ecc.)

Ripiegamento (folding) e modificazioni delle proteine Una catena polipeptidica neosintetizzata deve andare incontro a ripiegamento e a modificazioni chimiche per diventare una proteina funzionale Tutte le molecole di qualsiasi specie proteica adottano una sola delle possibili conformazioni (stato “nativo”), che è la forma tridimensionale più stabile per quella molecola tale da permettere alla proteina di svolgere la sua funzione

Il folding è co-traduzionale Il folding avviene durante la sintesi, inizia dal N-terminale, ed è in gran parte spontaneo. Il ripiegamento di una proteina è determinato dalla sequenza stessa degli aminoacidi.

Un anomalo ripiegamento di proteine è implicato in alcune malattie a lento sviluppo Esempio: placca di amiloide nella malattia di Alzheimer costituita da un fascio di filamenti proteici

Formazione di una proteina funzionale dopo taglio proteolitico di un precursore La chimotripsina è attivata per taglio proteolitico del chimotripsinogeno: in breve, il chimotripsinogeno, che è il precursore della chimotripsina, è prodotto a livello basale. In risposta a particolari stimoli, come la presenza di cibo nello stomaco o determinati ormoni, viene favorita l'azione della proteasi che taglia il chimotripsinogeno togliendo una sequenza che di solito inibisce il sito reattivo, rendendolo inattivo

Fosforilazione  defosforilazione (induzione cambiamenti conformazionali)

(compartimenti separati, attività specifiche) ORGANIZZAZIONE DI UNA CELLULA EUCARIOTICA COMPARTIMENTI INTRACELLULARI NUCLEO CITOPLASMA CITOSOL Sito della sintesi e degradazione delle proteine ORGANELLI (compartimenti separati, attività specifiche)

La sintesi inizia su ribosomi liberi nel citoplasma; nella sequenza amminoacidica del polipeptide prodotto c’è l’informazione che fornisce due possibili “destini”: La proteina va indirizzata ad uno specifico organulo La traduzione si arresta, la proteina raggiunge il RE e lì viene terminata la traduzione (ribosomi sul RE)

TRADUZIONE DELLE PROTEINE inizia SEMPRE sui ribosomi liberi Le proteine destinate al citosol, nucleo, mitocondri, cloroplasti, perossisomi, sono sintetizzate sui ribosomi liberi (via citoplasmatica) Le proteine destinate alla secrezione, RE, Golgi, lisosomi, membrana plasmatica sono sintetizzate sui ribosomi associati al reticolo endoplasmatico rugoso (RER) (via secretoria)

NELLA VIA CITOPLASMATICA LO SMISTAMENTO DELLE PROTEINE INIZIA DOPO IL COMPLETAMENTO DELLA TRADUZIONE

La sequenza aminoacidica di un polipeptide oltre a fornire l’informazione di tipo strutturale, può contenere delle “sequenze segnale” che stabiliscono la destinazione che il polipeptide avrà all’interno della cellula.

Le proteine prive di sequenze segnale rimangono nel citosol E’ la porzione di cellula all’interno della membrana plasmatica ma al di fuori degli organelli; vi troviamo il citoscheletro, i poliribosomi ed enzimi metabolici. Principali modificazioni covalenti reversibili delle proteine nel citosol: Metilazione/demetilazione Acetilazione/deacetilazione Fosforilazione/defosforilazione

Le proteine destinate al nucleo, ai mitocondri, ai cloroplasti o ai perossisomi, hanno delle specifiche sequenze segnale (o di localizzazione) all’estremità N-terminale o all’interno della catena amminoacidica. Es. proteine istoniche: -Pro-Pro-Lys-Lys-Arg-lys-Val-

Legame sequenza segnale a specifico recettore su membrana esterna organulo Il recettore forma un canale di membrana consentendo l’ingresso della proteina nell’organulo Per passare attraverso il canale la proteina viene di solito distesa da una chaperonina; raggiunto l’organulo riassume poi la conformazione normale

Proteine del nucleo passano dai pori nucleari Proteine sintetizzate nel citoplasma hanno segnale di localizzazione nucleare (Lys, Arg) e attraversano i pori nucleari

La maggior parte delle proteine destinate ai mitocondri vengono sintetizzate nel citosol e contengono specifiche sequenze di inserimento

Per entrare nei mitocondri le proteine devono “distendersi” “Chaperones” citosolici portano le proteine su recettori legati a traslocatori inseriti nella membrana esterna del mitocondrio Le proteine chaperones dentro gli organelli fanno recuperare la conformazione alla proteina L’inserimento delle proteine mitocondriali richiede energia

Perossisomi Responsabili della degradazione di acidi grassi e composti tossici (sottoprodotti del metabolismo cellulare) membrana singola contengono ossidasi e catalasi che degradano i ROS le proteine dei perossisomi provengono dalla via citoplasmatica

Trasporto ai perossisomi Le proteine sintetizzate nei ribosomi liberi hanno sequenza segnale (ser-leu-ser) che è riconosciuta da peroxine che le introducono nel perossisoma In alcune malattie genetiche è difettivo il meccanismo di indirizzamento ai perossisomi

LO SMISTAMENTO INIZIA DURANTE LA TRADUZIONE Via secretoria: RER- GOLGI- vescicole secretorie- spazio extracellulare LO SMISTAMENTO INIZIA DURANTE LA TRADUZIONE

Reticolo endoplasmatico (RE) rete formata da cisterne e vescicole chiuse da membrana comprende regioni “lisce” e regioni “ruvide” (coperte di ribosomi)

Il reticolo endoplasmatico ruvido (RER) è una serie estesa di cisterne interconnesse sulla cui membrana sono adesi i ribosomi

Reticolo endoplasmatico (RE) sintesi della maggior parte dei lipidi (REL) sintesi e modificazioni della maggior parte delle proteine di membrana (RER) immagazzinamento degli ioni Ca++ (REL) Detossificazione (REL)

“Sequenze-segnale” sulle proteine secretorie nascenti indirizzano al RE tutto il macchinario traduzionale Quando all’N-terminale di un polipeptide c’è sequenza di 15-30 aa (soprattutto idrofobici), la proteina viene inviata al RE e da lì al Golgi. Da qui può esser modificata per il suo successivo trasporto ai lisosomi, alla membrana plasmatica o all’esterno della cellula.

Struttura della Particella di Riconoscimento del Segnale (SRP) RNA proteine

Sequenza segnale emerge dai ribosomi Riconoscimento da parte di una particella di riconoscimento del segnale (SRP) SRP lega ribosomi (blocco sintesi) e un recettore per SRP sul reticolo, trasferendo il complesso (catena nascente, ribosomi, SRP) al RE rugoso

4. Rilascio dell’SRP dal complesso e legame del ribosoma al complesso di traslocazione delle proteine con inserimento della sequenza segnale in un canale sulla membrana (traslocone) 5. Alla ripresa della traduzione, la sequenza segnale viene rimossa da una peptidasi del segnale e la catena polipetidica sintetizzata è rilasciata nel lume del RE

il “recettore del ribosoma” Particella di riconoscimento del segnale (SRP) il “recettore del ribosoma”

Modificazioni post-traduzionali e controllo di qualità nel RER I polipeptidi neosintetizzati nella membrana del RER e rilasciati nel lume (senza mai mescolarsi alle molecole presenti nel citoplasma !) possono subire: Glicosilazione (ER, Golgi) Formazione di ponti disolfuro (ER) Folding e struttura quaternaria (ER) Proteolisi (ER, Golgi e vescicole secretorie)

L’oligosaccaride è sintetizzato ancorato alla membrana flip flop il dolicolo cede alla proteina un oligosaccaride poi modificato nel Golgi

A questo punto le proteine dal lume del RE passano al complesso di Golgi mediante un sistema di vescicole

Il complesso di Golgi Serie di compartimenti e vescicole appiattite composte di tre regioni: cis (ingresso), mediana e trans (uscita) Ogni regione contiene un set diverso di enzimi per le modificazioni delle proteine Modifica e smista molti prodotti del RE (lisosomi, membrana plasmatica, secrezione)

Proteine destinate al RE spesso vengono recuperate dal Golgi cis e ri-inviate al RE (trasporto retrogrado) segnale KDEL (lys-asp-glu-leu)

Nelle cisterne del Golgi: Modificazione della parte glucidica Sintesi di glicolipidi, sfingomielina e polisaccaridi complessi della matrice extracellulare Idrolasi lisosomiali fosforilate in un residuo di mannosio Il Mannosio 6-fosfato è il segnale che indirizza le proteine ai lisosomi

Lisosomi generati da Golgi N° variabile membrana singola pH nel lume  5 idrolasi acide

Responsabili della degradazione di: materiale internalizzato dalla cellula alcuni componenti cellulari (autofagia)

La via del mannosio 6-fosfato (M6P)

Visione d’insieme della “via secretoria”

Sia la via secretoria verso l’esterno (RER-GOLGI-MEMBRANA) sia quella endocitica verso l’interno utilizzano vescicole di trasporto che devono portare specifici marcatori di destinazione

Formazione di vescicole richiede GTP TRASPORTO VESCICOLARE-FORMAZIONE DELLE VESCICOLE VESCICOLE RIVESTITE DA COAT PROTEIN (COP) VESCICOLE RIVESTITE DI CLATRINA Assunzione di molecole extracellulari e per trasporto dal Golgi ai lisosomi COP I gemmano dal Golgi COP II gemmano dal RE Formazione di vescicole richiede GTP C’è riconoscimento tra recettori sulla membrana della vescicola e quelli sulla membrana del compartimento.

Molte proteine integrali di membrana sono sintetizzate sul RE Inserite nella membrana mediante sequenze idrofobiche

Controllo post-traduzionale che regola la longevità di una proteina Due pathways principali per degradare le proteine: Attraverso il lisosoma (non specifico, principalmente per proteine extracellulari) Attraverso il sistema del proteasoma/ubiquitina (molto regolato e specifico)

Ubiquitina e ubiquitilazione L’ ubiquitina è una proteina di 76 aminoacidi. E’ altamente conservata negli eucarioti: l’ubiquitina umana e quella di lievito hanno il 96 % di identità di sequenza. La sua principale funzione è quella di marcare le proteine che devono essere distrutte, un processo noto come proteolisi. Molte molecole di ubiquitina si attaccano alla proteina bersaglio (poliubiquitinazione), che viene trasportata al proteasoma, una struttura a forma di cilindro dove avviene la proteolisi.

Le principali caratteristiche dell’ubiquitina risiedono nella sua coda C-terminale (residuo di Gly che lega una lisina nelle proteine bersaglio) e nei residui di lisina (la lisina 48 e’ il sito al quale si lega la successiva molecola di ubiquitina, formando una catena di poliubiquitina).

Degradazione delle proteine attraverso la via dell’ubiquitina

Perché il malfunzionamento del sistema ubiquitina-proteasoma può causare malattia ? (es. Cicline, TF) Malattia Substrato Proteico Livello ridotto Aumento Degradazione Proteasoma/ Ubiquitina mutazione Degradazione normale Diminuzione Degradazione Substrato Proteico Substrato Proteico Livello aumentato Livello normale Funzione normale Malattia