Studi di strutture di ordine superiore di proteine mediante spettrometria di massa da un lavoro di R. Kriwacki, N. Reisdorph e G. Siuzdak Spectroscopy 18 (2004) p Res Hospital (Tennessee) e Scripps Res Institute (California) - USA) Nel campo delle proteine, oltre che per la definizione della struttura primaria, la spettrometria di massa può essere utilizzata per studiare ordini superiori di struttura attraverso frammentazione “blanda” con enzimi proteolitici che riconoscono sequenze specifiche.

Esempi di specificità di sequenza per alcune proteasi

Tripsina: E' molto specifica, scinde i legami peptidici dopo residui di Arginina o di Lisina; non è in grado di svolgere la propria attività catalitica nel caso in cui l'amminoacido che segue tali residui sia una Prolina. Chimotripsina: non è estremamente specifica, scinde i legami peptidici dopo residui idrofobici, soprattutto: Phe, Trp, Tyr e Leu.

Proteasi Arg-specifica: scinde i legami peptidici dopo residui di Arginina. Proteasi Lys-specifica: scinde i legami peptidici dopo residui di Lisina. Proteasi da Staphylococcus aureus (V8 proteasi): in tampone ammonio carbonato, pH 8, questo enzima scinde solo i legami Glu-X. Proteasi meno specifiche. Un esempio è la pepsina. La sensibilità dei legami peptidici all'azione di questo enzima varia da proteina a proteina. Presenta una maggiore specificità per i legami peptidici in cui intervengono dei residui di Phe e Leu, sebbene sia capace di idrolizzare anche molti altri legami. Agisce a pH acido.

La specificità per la sequenza dell’enzima proteolitico gioca un ruolo importante nell’applicazione della spettrometria di massa alla definizione della struttura di proteine. Tuttavia altri fattori sono anche importanti: l’accessibilità e la flessibilità dei siti per le proteasi. Infatti, idealmente, solo pochi siti potrebbero essere attaccati dagli enzimi in seguito all’inaccessibilità di altri siti o alla particolare (non)flessibilità (dinamica) di specifiche porzioni della proteina ed a seguito della formazione di più alti ordini strutturali.

Esempio di degradazione selettiva di una proteina attraverso una idrolisi enzimatica “blanda”. Le frecce indicano siti potenziali di attacco da parte della proteasi su una ipotetica proteina. Questi sono esposti sulla superficie della proteina. Se è stata utilizzata una proteasi specifica, i siti indicati devono anche contenere la sequenza riconosciuta dalla proteasi. Lo spettro di massa della miscela dei frammenti proteolitici consente di ottenere una “mappa” della degradazione che contiene informazioni sulla struttura.

La Tripsina e la proteasiV8, che tagliano, rispettivamente, siti basici (K, R) e siti acidi (D, E) sono buone scelte (sono siti che generalmente occupano la superficie esterna della proteina in studio). Le condizioni di reazione devono essere controllate per produrre solo una proteolisi limitata in modo che il pattern di idrolisi sia affidabile per quel che riguarda la struttura nativa terziaria. Inoltre, anche la scissione di un singolo specifico legame peptidico potrebbe destabilizzare la struttura della proteina, causando cambiamenti strutturali locali o addirittura la denaturazione di tutta la struttura favorendo reazioni di scissione successive non avrebbero informato sulla struttura originaria.

La mappatura della massa di frammenti proteici può anche essere usata per studiare la struttura quaternaria di complessi multicomponenti come i complessi proteina-proteina o proteina- DNA e perfino virus intatti. La prima applicazione di proteolisi limitata e spettrometria di massa MALDI allo studio di un sistema multicomponente è stato eseguito da Chait e collaboratori nel Nei loro studi, questo approccio combinato è stato utilizzato per analizzare la struttura della proteina di un fattore di trascrizione, sia libero in soluzione, che legato ad un oligonucleotide contenente il sito specifico di legame del DNA.

La caratteristica comune nell'analisi sia di complessi proteina-proteina che di complessi proteina-DNA è che la proteasi fornisce una sorta di contrasto tra gli stati associati e non associati del sistema. La formazione di un'interfaccia tra una proteina e un'altra macromolecola proteggerà siti altrimenti raggiungibili per le proteasi e quindi fornisce informazioni sui residui che formano l'interfaccia.

Riconoscere i cambiamenti conformazionali La mappatura della massa proteica può essere usata per riconoscere semplici variazioni conformazionali di proteine. Ad esempio, dati di cristallografia a raggi X hanno mostrato che la calmodulina subisce variazioni conformazionali in presenza di ioni calcio (indicati in verde nella figura). La struttura terziaria della calmodulina consiste in una forma a manubrio (pesi) con due domini globulari separati da un segmento in alfa-elica. È stato proposto che il calcio attivi la calmodulina esponendo residui idrofobici vicino alle due estremità dell'elica centrale. Le mappe di massa risultanti dall’azione della tripsina, chimotripsina e pepsina hanno dimostrato che la proteina ha subito un cambiamento strutturale in presenza di calcio.

La figura mostra gli spettri di massa dei digeriti tripsici della calmodulina in presenza e assenza di calcio. Il confronto rivela differenze corrispondenti alle linee di frattura nella regione centrale elicoidale della proteina. Sulla base dei risultati di questo esperimento relativamente semplice, si possono apprezzare i cambiamenti strutturali causati da Ca 2+, che provocano una reattività alterata della proteasi.

La spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray è stata utilizzata anche per monitorare il ripiegamento delle proteine perché alcune proteine ​​ mostrano una netta differenza nel loro stato di carica in funzione della loro conformazione soluzione. Nell’esempio, relativo alla fibronectina, sono mostrate due distribuzioni di carica: una meno carica (in media +6) relativa alla forma nativa ed una con carica più alta relativa al conformero denaturato (fino a +12). La differenza tra gli spettri è dovuto ai siti di protonazione aggiuntivi disponibili in forma denaturata.

L'impiego dello scambio idrogeno/deuterio (H/D) per studiare le variazioni conformazionali in proteine ​​ o interazioni proteina/proteina è stato effettuato utilizzando ESI-MS, anche a volte MALDI-MS. Il concetto di questo approccio è relativamente semplice: i protoni all'interno della porzione delle proteine ​​ in stretto contatto inter- o intra-molecolare possono formare legami idrogeno e avranno differenti velocità di scambio rispetto ad altri in regioni del sistema più accessibili al solvente. Monitorando questo scambio di idrogeno, possono essere acquisite informazioni sulla struttura covalente di una proteina da sola o in un complesso.

Altri metodi per sondare strutture di ordine superiore includono studi di reattività chimica dei singoli aminoacidi in una proteina e studi di topologia mediante reazioni di cross-linking. Entrambi gli approcci derivano dal fatto che la tecnica MALDI ha dimostrato di essere un metodo efficace per la caratterizzazione di modifiche post- traduzionali. Es.: con l'uso di acilazione o succinilazione, Glocker et al. hanno dimostrato che vi è una chiara correlazione tra la reattività relativa degli amminoacidi specifici e la loro accessibilità al solvente sulla superficie della proteina.

Un semplice esempio di tale reattività viene mostrato per una proteina virale che, dopo essere stata esposta ad acetilazione, ha mostrato una reattività chimica limitata. I risultati indicano anche la potenzialità di analisi del metodo per la caratterizzare della superficie esposta del sistema determinando i siti di modificazione.

Studi chimici di trattamento delle proteine, o subunità proteiche, ​​ con reticolanti, prima di digerire con enzimi, hanno messo in evidenza le regioni proteiche adiacenti che vengono legate covalentemente. I frammenti proteolitici risultanti sono buone indicazioni della struttura complessiva terziaria e/o quaternaria della proteina. Tuttavia, l’interpretazione dei risultati di proteolisi può essere difficile. In questo caso può essere utilizzata la marcatura isotopica selettiva delle singole unità per semplificare l'interpretazione dei dati di massa (marcare specifiche subunità prima della complessazione e proteolisi).

La reticolazione chimica è stato impiegato per determinare la stechiometria di oligomeri con analisi MALDI-MS. L’analisi MALDI di un complesso prima della reticolazione consente la determinazione della massa molecolare delle singole unità. Un agente di reticolazione, come la glutaraldeide, che reagisce principalmente con il gruppo  -amminico della lisina per dare reticolazione (la reazione può essere fermata con l'aggiunta della matrice MALDI).