LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE ESPERIENZA N. 1: DETERMINAZIONE SPETTROENZIMATICA DELL’AMIDO

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE AMIDO: POLISACCARIDE DI RISERVA DEL REGNO VEGETALE

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE AMIDO: POLISACCARIDE DI RISERVA DEL REGNO VEGETALE Si trova principalmente negli organi di riserva (tuberi, radici, semi ecc.) E’ un polimero del glucosio con legami a1,4 (amilosio) e a1,6 (amilopectina)

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE AMIDO e CELLULOSA: Legame a 1,4 Legame a 1,6

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Altri zuccheri di riserva sono: b 1,6 Definiti in generale fruttosani b 1,2

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE TIPOLOGIE DI AMIDO

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE PERICARPO PARETE CELLULARE PROTEINA AMIDO ENDOSPERMA AMIDACEO

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Principio del metodo Il metodo utilizzato sfrutta il differente spetto di assorbimento nell’UV-Vis. della forma ossidata e di quella ridotta dell’NADP

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Reazioni Si effettuerà un dosaggio utilizzando un sistema spettro-enzimatico, mediante questo sistema di reazioni: Amido + (n-1) H2O n D-glucosio; D glucosio + ATP G-6-P + ADP; G-6-P + NADP+ D-gluconato 6P + NADPH + H+ Le reazioni sono stechiometriche per cui si otterrà una quantità di NADPH proporzionale alla quantità di amido presente. AGS = amiloglucosidasi; HK = esochinasi G6P-DH = glucosio 6-P deidrogenasi AGS HK G6P-DH

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Contenuto del Kit: Soluzione 1: amiloglucosidasi in buffer citrato; Soluzione 2: NADP, ATP in trietanolamina buffer; Sospensione 3: miscela di esochinasi e glucosio 6-P deidrogenasi

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Contenuto del Kit: Soluzione 2 NADP, ATP Soluzione 1 Amiloglucosidasi Sospensione 3 Esochinasi e Glucosio 6P deidrogenasi

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Reagenti necessari: Dimetilsulfossido (DMSO) ed HCl 8M per solubilizzare l’amido; NaOH 5 M per aggiustare il pH; Kit enzimatico.

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Strumentazione: Bagno termostatato a 55 60°C Spettrofotometro regolato a 340 nm

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Preparazione del campione: Polverizzare il campione con un mulino o un omogenizzatore; Pesarne accuratamente 100 mg; Porli in una beuta ed aggiungere 20 ml di DMSO e poi 5 ml di HCl 8M Parafilmare e porre ad incubare per 30’ a 60°C; Raffreddare rapidamente a 20 25°C con 50 ml di H2O e portare il pH a 4–5 con NaOH 5M; Portare a volume fino a 100 ml. Prelevare 100 ml per ogni determinazione.

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Procedimento:

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Calcolo: Contenuto amido g/l soluzione: Dove: DA = (A2 – A1) campione – (A2- A1) del bianco V = volume finale (ml) = 2,320; PM = Peso Molecolare glucosio – Peso Molecolare acqua = 162,1; v = volume del campione (ml) = 0,100; d = lunghezza del cammino ottico (cm) = 1 e = coefficiente di estinzione molare dell’NADPH a 340 nm = 6,3

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Calcolo: Contenuto amido g/l soluzione: C = 0,597 x DA

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido Calcolo: Contenuto amido g/100g PS :

LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE Determinazione dell’amido FINE