Prof. Riccardo Gavioli tel:

Il virus

Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS Diversi sottotipi di virus Il virus muta Mancanza di modelli animali Quali risposte immuni sono protettive? Quale parte del virus usare in un vaccino? Che via di somministrazione usare? Che adiuvante usare? Pochi investimenti dell’industria farmaceutica

Sottotipi di HIV

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Il virus muta

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Mancanza di modelli animali

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Risposte immuni contro HIV Anticorpi Linfociti helper Linfociti citotossici CD4 T cell CTL MHC-II MHC-I TCR

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Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS ? ? ? X Proteine strutturali Proteine regolatorie

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Vie di somministrazione

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ADIUVANTE + ALUM + citochina

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Vaccino italiano: perchè Tat? E’ indispensabile al virus per duplicarsi Muta poco ed è conservata tra i diversi sottotipi I soggetti con risposte anti-Tat sviluppano la malattia più tardi

Studi preclinici nel topo TAT MEPVDPRLEPWKHPGSQPKT ACTNCYCKKCCFHCQVCFIT KALGIS YG RK KRRQRRR PPQGSQTHQVSLSKQ PTSQSRGDPTGPKE VCFITKALGISYGRK GSQTHQVSLSKQPTS TAT La vaccinazione con Tat è sicura La vaccinazione con Tat induce risposte immuni anticorpali La vaccinazione con Tat induce risposte immuni cellulari MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRK KRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE CTL MHC-I TCR MHC-II CD4 T cell TCR

Conclusione degli studi preclinici La scimmia trattata con Tat e messa a contatto con il virus, non sviluppa l’infezione!

Sviluppo del vaccino basato sulla proteina Tat Presentazione del dossier per la sperimentazione sull’uomo Fase I: sicurezza Fase II: sicurezza e immunogenicità Fase III: sicurezza, immunogenicità e efficacia

FASE I SULL’UOMO VACCINO PREVENTIVO Protocol Number: ISS-P001 VACCINO TERAPEUTICO Protocol Number : ISS-T001

FASE II VACCINO TERAPEUTICO ATTUALMENTE IN CORSO IN ITALIA VACCINO PREVENTIVO PARTIRA’ IN AFRICA

Vaccini di seconda generazione: vaccini combinati I vaccini basati su componenti strutturali del virus (Env, Gag) hanno fallito I vaccini basati su componenti regolatorie (Tat, Nef, Rev) sono sicuri ed immunogenici negli animali e nell’uomo Vaccini combinati??? +

FP6-EU Commission in Poverty Diseases

AVIP Consortium P nameInstitutionP short nameCountry EnsoliIstituto Superiore di Sanità RomaISSItaly WahrenKarolinska InsituteKISweden Le GrandCommissariàt à l’Energie AtomiqueCEAFrance GavioliUniversity of FerraraUNIFEItaly GuzmanGerman Center for BiotechnologyGBFGermany MagnaniUniversity of UrbinoUNIURBItaly KrohnFIT BiotechFITFinland ErfleCentre for Enviromental and Health Res.GSFGermany Rappuoli/BarnettChiron/NovartisCHIRONItaly GotchImperial College LondonICSTMUnited Kingdom VardasUniversity of WitwatersrandWHCSouth Africa GlashoffUniversity of StellemboschUSSouth Africa ClericiUniversity of MilanUNIMIItaly PoliSan RaffaeleDIBITItaly HolmesNational Institute fro Biological StandardsNIBSCUnited Kingdom CaputoUniversity of PaduaUNIPDItaly

Studi preclinici nel topo Risposte immuni dopo vaccinazione con un singolo componente: Env Risposte immuni di vaccini combinati contenenti Tat: Env + Tat +

PBS Env Env + Tat Risposte immuni contro Env Immunization Positive responses Gavioli et al., Vaccine, 2006 Cellini et al. Virol J., 2008 Patent: Vaccines N. PCT/EP2004/011950)

Risposta immune ad un antigene 2. cellulare1. anticorpale

MHC di classe IMHC di classe II

MHC di classe I MHC di classe II

Peptide binding motif

Associazione del peptide alle molecole di MHC-I     2 m Posizione 2 C-terminale

Proteasoma e generazione dei peptidi che legano le molecole di MHC-I

Antigen processing ubiquitinazione Nucleo Proteina virale Epitopo immunogenico Degradazione nel proteasoma

basecoperchio Complesso 19SCore 20S Proteasoma 26S + + Rappresentazione schematica del proteasoma 26S (core 20S + regolatore 19S)

Ubiquitina e marcatura delle proteine

Ubiquitina: Piccola proteina globulare di 8 KDa Costituita da 76aa Ubiquitaria e altamente conservata Struttura tridimensionale rigida e compatta

Vie di sintesi dei monomeri di ubiquitina Ub UBP Ub Catena di poli-ubiquitina neosintetizzata UCH Ub Subunità ribosomiali UCH proteine ribosomiali Ub Catena di poli-ubiquitina in fase di disassemblaggio Ub Proteina ubiquitinata proteina Ub

proteasoma ATP AMP+PPi + SH E1 Ub C O OH SH Ub C O E1 SH E2 SH E1 SH Ub C O E2 E3 NH 3 - S SH E2 Ub NH S (Ub) n Ubpeptidi Ub aminoacidi ATP AMP+PPi

proteina G K6K6 G K6K6 G K6K6 K K6 o K9 ? G K 29 K G G proteolisi G G K 48 K G proteolisi G proteina G K 63 K G riparazione DNA regolazione ribosomale attiviazione chinasi endocitosi di recettori di membrana G K mono ubiquitinazione funzioni non proteolitiche proteina Funzioni dell’ubiquitina

Struttura del core 20S 77 22 66 33 55 44 11 66 55 44 77 11 55 22 33 44 66 77 44

Ingresso alla camera proteolitica Ingresso chiusoIngresso aperto

Camere interne al proteasoma camera proteolitica centrale anticamera

REGOLAZIONE DELLE ATTIVITA’ PROTEOLITICHE

I regolatori del proteasoma

Core 20S + regolatore 19S = proteasoma 26S

Regolatore 19S Formato da: una base  2 subunità di grandi dimensioni + 6 subunità ATPasiche un coperchio  8 subunità Funzioni: –Riconoscimento delle proteine target marcate con ubiquitina –Attività deubiquitinante –Controllo dello stato di apertura del canale del proteasoma –Accessibilità alla camera proteolitica –Determina l’unfolfing delle proteine da degradare

Regolatore PA28 associato al proteasoma PA28Core 20S Proteasoma 26S + + PA28

Il regolatore PA28 Complesso eterodimerico: 6 subunità, 3  e 3  Funzioni: –aumenta l’efficienza di degradazione del proteasoma –Favorisce la fuoriuscita dei prodotti (peptidi) La sua espressione è regolata dall’IFN- 

Immunoproteasoma

I peptidi antigenici derivano dalla degradazione di: Proteine citosoliche, nucleari e di membrana Proteine non conformate DRIPs

proteina epitopo -COOHNH 2 - -COOH NH 2 - -COOH NH 2 - -COOHNH 2 - -COOHNH 2 - -COOH NH 2 - -COOH NH 2 - -COOH NH 2 - -COOHNH 2 - -COOHNH 2 - Epitopo corretto Estensioni all’N-terminale Estensioni al C-terminale Taglio dell’epitopo -COOH NH 2 - Estensioni all’N- e C-terminale

Antigen processing ubiquitinazione Aminopeptidasi Citoplasmatiche Nucleo Proteina virale Epitopo immunogenico Degradazione nel proteasoma

LE AMINOPEPTIDASI Ruolo Svolgono un ruolo fondamentale nella formazione dell’epitopo immunogenico: infatti il proteasoma è in grado di generare solo l’estremità C- terminale mentre per l’N- terminale intervengono le aminopeptidasi. Si distinguono in: Citoplasmatiche Endoplasmatiche

Ruolo delle peptidasi citosoliche nella presentazione antigenica

Classificazione delle peptidasi citosoliche COMPLETANO L’ATTIVITA’ DEL PROTEASOMA DISTRUGGONO I PEPTIDI GENERATI DAL PROTEASOMA TPPII (TRIPEPTIDYL PEPTIDASE II) TOP (THIMET OLIGOPEPTIDASE) BH (BLEOMYCIN-HYDROLASE) PSA (PUROMYCIN SENSITIVE AMINOPEPTIDASE) LAP (LEUCYN-AMINOPEPTIDASE)

Ap. Golgi Espressione del complesso MHC-I/peptide MHC I vuoto Formazione del complesso MHC-I/peptide TAP1 TAP2 Trasferimento nel Reticolo Endoplasmatico Degradazione nel proteasoma ubiquitinazione Aminopeptidasi Citoplasmatiche Nucleo Proteina virale Epitopo immunogenico e del Reticolo Endoplasmatico

Una proteina come immuno- modulatore Parte II

Immunomodulatory effects of Tat protein Tat promotes MDCC maturation and activation Tat induces immunoproteasomes in MDCC Tat modifies expression and activity of immunoproteasomes in T and B cells Tat favors the presentation of subdominat T cell responses in viral infected cells Tat increases memory T cell reactivation Fanales-Belasio et al., J.Immunol. 2002

Immunomodulatory effects of Tat protein MECL1  Subunits LMP2 LMP7 0 24h 48h 72h 0.5  g/ml Tat 0 0,  g/ml Tat Gallerani et al., unpublished Tat promotes MDCC maturation and activation Tat induces immunoproteasomes in MDCC Tat modifies expression and activity of immunoproteasomes in T and B cells Tat favors the presentation of subdominat T cell responses in viral infected cells Tat increases memory T cell reactivation

Immunomodulatory effects of Tat protein LMP7 LMP2 MECL1 PA28a 22 0 Tat B CellsT Cells Gavioli et al., J.Immunol Remoli et al., Biochemical J Tat promotes MDCC maturation and activation Tat induces immunoproteasomes in MDCC Tat modifies expression and activity of immunoproteasomes in T and B cells Tat favors the presentation of subdominat T cell responses in viral infected cells Tat increases memory T cell reactivation

Immunomodulatory effects of Tat protein Fluorescence units Chimotrypsin-like activity Trypsin-like activity Post-acidic activity MinMin-Tat MonMon-Tat Gavioli et al., J.Immunol Tat promotes MDCC maturation and activation Tat induces immunoproteasomes in MDCC Tat modifies expression and activity of immunoproteasomes in T and B cells Tat favors the presentation of subdominat T cell responses in viral infected cells Tat increases memory T cell reactivation

Immunomodulatory effects of Tat protein Gavioli et al., J.Immunol Patent: Vaccines N. PCT/EP2004/011950) Tat promotes MDCC maturation and activation Tat induces immunoproteasomes in MDCC Tat modifies expression and activity of immunoproteasomes in T and B cells Tat favors the presentation of subdominat T cell responses in viral infected cells Tat increases memory T cell reactivation

Immunomodulatory effects of Tat protein Cellini et al., unpublished % Specific lysis Peptide CLG YLQ IVT Tat 0,5  g/ml Tat promotes MDCC maturation and activation Tat induces immunoproteasomes in MDCC Tat modifies expression and activity of immunoproteasomes in T and B cells Tat favors the presentation of subdominat T cell responses in viral infected cells Tat increases memory T cell reactivation

Vaccine studies Immune responses in mice vaccinated with single antigens: Gag Env Env V2-deleted Immune responses in mice vaccinated with single antigens in combination with Tat: Gag + Tat Env + Tat Env V2-deleted + Tat

Effect of Tat on epitope-specific T cell responses against the HIV-1Gag antigen GroupTreatmentRoute # 1PBS/Freund 100 µL subcute # 2Gag/Freund # 3Gag + Tat/Freund Immunization protocol Gag/Tat Gag protein: HIV SF2 Gag peptides (15mers overlapping by 10 aa, of clade B HIV-1) Tat: HIV III B (Hxbc2, Clone BH10) 1st2nd 3rd sacrifice 38 Schedule of immunization

PBS Gag Gag + Tat Gag peptides inducing IFN-  responses Immunization Positive responses

Effect of Tat on epitope-specific T cell responses against the HIV-1Env antigen GroupTreatmentRoute # 1PBS/Alum 100 µL subcute # 2Env/Alum # 3Env + Tat/Alum Immunization protocol Env/Tat Env protein: SF1623-gp160 Env peptides (15mers overlapping by 10 aa, of SHIV-1) Tat: HIV III B (Hxbc2, Clone BH10) 1st2nd 3rd sacrifice 38 Schedule of immunization

PBS Env Env + Tat Immunization Positive responses Env peptides inducing IFN-  responses

PBS Env Env + Tat Immunization Positive responses Env peptides inducing IL4 responses

Tat ha un effetto su altre infezioni virali?

028 Intravaginal (IV) inoculation of HSV-1 LVLacZ (control) or HSV-1 LVTat Intravaginal (IV) challenge with HSV-1 wt Effects of Tat on HSV1 infection

The presence of Tat increases the cellular response against the HSV-1 immunodominant and subdominant epitopes. HSV1-LVLacZ HSV1-LVTatHSV1-LVLacZ HSV1-LVTat IFN-γ Assay Cellular response

Humoral response

MICE DISEASE PROGRESSION AFTER CHALLENGE (letal doses) WITH HSV-1wt