Un processo separativo di tipo cromatografico ha quindi come risultato un profilo di concentrazione risolto nello spazio o nel tempo di forma gaussiana. IL PICCO CROMATOGRAFICO t R viene misurato nel punto di massimo del picco; W b viene ottenuto tracciando le tangenti al punto di flesso e misurando l’intercetta sulla linea di base W h è la larghezza del picco misurata al 50% dell’altezza W i è la larghezza del picco misurata ai punti di flesso

PIATTI TEORICI La teoria dei piatti considera il sistema cromatografico come un sistema statico in equilibrio. Ciascun analita stabilisce un equilibrio di ripartizione tra la fase mobile e la fase stazionaria. Ciascuno di questi equilibri definisce un piatto teorico A fase mobile A fase stazionaria I quattro concetti importanti per capire ed ottimizzare le condizioni separative sono: k’ Fattore di capacità  Selettività N Efficienza del sistema (numero di piatti teorici) R Risoluzione Gli analiti vengono trascinati dalla fase mobile attraverso la fase stazionaria e separati in base alla loro differente affinità per le due fasi.

Il numero dei piatti teorici dipende dalla lunghezza del sistema separativo, per questo è utile ricavare l’altezza equivalente del piatto teorico (HETP), che generalmente si esprime in millimetri. EFFICIENZA SEPARATIVA lunghezza della colonna in mm Il concetto di piatto è usato nella distillazione frazionata, dove si considera che ogni stadio di condensazione/evaporazione avvenga su un diverso livello o piatto (questi piatti esistono effettivamente in molte colonne di distillazione) In cromatografia i piatti sono una rappresentazione teorica degli stadi di ripartizione (distribuzione) che le molecole incontrano durante il loro passaggio nel sistema separativo. L’efficienza è tanto più elevata quanto minore è H e maggiore è N.

Quindi l’efficienza separativa è un indice di quanto si riesca ad evitare l’allargamento di banda durante la corsa cromatografica. Occorre comunque considerare che all’aumentare del tempo di residenza dell’analita nella colonna diventano sempre più importanti i fenomeni di diffusione laterale lungo la colonna stessa e che quindi i picchi che escono a tempi di ritenzione elevati saranno sempre più larghi di quelli che escono prima. Esistono inoltre allargamenti di banda extra-colonna, dovuti alla diffusione laterale che avviene nei tubi di connessione e nella cella del rivelatore, che devono essere ridotti al minimo mediante un opportuno disegno strumentale. FATTORI INFLUENZANTI L’EFFICIENZA

Esempio : Esempio : un analita eluisce da una colonna sotto forma di un picco Gaussiano con un tempo di ritenzione di 7 min 45 s e una larghezza della base del picco di 30 s. Calcolate: (i) il numero di piatti teorici della colonna; (ii) l’altezza dei piatti se la colonna e’ lunga 7 cm (i) N = 16 x (465/30)^2, quindi N = 3844 (ii) H = L/N = 7.5 x 10^4 / 3844, quindi H = 19.5  m

Random Elements to Motion  Random length of time that each molecule spends in the stationary phase  Longitudinal diffusion: solute molecules tend to diffuse from more to less concentrated regions. Therefore some molecules move faster, some move slower than average in direction of flow  Eddy diffusion: if the column is packed with particles of (or supporting) the stationary phase - there are many possibilities for differing routes down the column: All of these mechanisms have more time to operate, the longer the column. Hence increased line broadening down the column

LONGITUDINAL DIFFUSION (MOBILE PHASE) Longitudinal diffusion in column chromatography is a band broadening process in which analytes diffuse from the concentrated center of a band to the more dilute regions ahead of and behind the band center. Toward and opposed to the direction of flow of the mobile phase. B is directly proportional to the diffusion coefficient, which is a constant equal to the rate of migration under a unit concentration gradient. The diffusion coefficients in liquids are orders of magnitude smaller than those in gases and therefore the role of the B term plays a small role on the band broadening in HPLC

MASS TRANSFER (Adsorption Kinetics) Stationary phase mass transfer Mobile phase mass transfer

VAN DEEMTER EQUATION HETP = H = A + B/  + C  A - Multipath effect (Eddy diffusion) B/  - Longitudinal diffusion C  - Mass transfer term

Particle size of column packings: in many columns, (esp. HPLC) the stationary phase is supported on small particles. The smaller the packing particles, the greater the column efficiency.

FATTORE DI CAPACITA` Il fattore di capacità di un composto esprime il suo tempo (volume) di ritenzione corretto rispetto al tempo (volume) morto ed è calcolato come segue: Il fattore di capacità è simile ad una costante di equilibrio. Rappresenta la misura del tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria rispetto al tempo di residenza nella fase mobile durante il passaggio attraverso il sistema separativo. Maggiore è il fattore di capacità, più alto è il tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria e più tardi il composto eluisce. Il fattore di capacità è indipendente dalla velocità di flusso e dal sistema in generale. E`una funzione della capacità di ritenzione del sistema separativo accoppiata alle interazioni della fase mobile. k’ (fattore di capacità) = (t R - t M ) / t M = t’ R / t M

DIPENDENZA DEL FATTORE DI CAPACITA`

Column Resolution A quantitative measure of the ability of a column to separate two analytes, A and B: Defined as follows: R s = 0.75  incomplete resolution R s = 1.5  essentially complete resolution For R s = 1.0, zone A contains 4% B and vice versa. For increased resolution use longer column - but (i) longer time & (ii) broader bands Usually compromise between resolution and speed of analysis

The General Elution Problem Mixture of 6 components with very different partition coefficients - hence very different elution times. In (a) - optimum for 1 & 2 - excessive time for 5 & 6. In (b) optimum for 5 & 6, but 1/2 & 3/4 not resolved. Solution - programme the elution so that the conditions start of as in (a), change to optimum for 3 & 4 (c), then finally as in (b). This can often give good resolution for a complex mixture in a reasonable time.