CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’ Un ligando specifico per la proteina di interesse viene legato covalentemente alla resina

2 Interazioni altamente specifiche delle biomolecole: -anticorpo-antigene -Enzima-inibitore reversibile -Enzima-analogo del substrato -Acido nucleico-frammento acido nucleico complementare -Enzima-coenzima -Lectina-glicoproteina La molecola da purificare interagisce in maniera reversibile con un ligando covalentemente fissato sulla matrice insolubile della fase stazionaria. Si forma così un complesso tra molecola da purificare e ligando CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ

MATRICE: Deve essere stabile, rigida, un basso potere adsorbente ed avere una grande area di superficie Tra le matrici utilizzate: agarosio, cellulosa, destrano e poliacrilammide

SPAZIATORE: Catena di atomi di carbonio che uniscono la matrice al ligando La sua lunghezza è critica per l’efficienza della cromatografia: Se troppo lungo può interagire con le proteine (interazioni idrofobiche) Se troppo corto può ostacolare il legame tra il ligando e la molecola da purificare

LIGANDO: -GENERICO: -GENERICO: una molecola lega gruppi specifici di molecole target Proteina A/G: interagiscono con la parte Fc delle immunoglobuline G (IgG) Lectine: interagiscono reversibilmente con zuccheri specifici. Permettono di separare glicoproteine, glicolipidi, polisaccaridi etc Poly(U): permette la separazione selettiva di mRNA Coloranti: coloranti sintetici come il Cibacron Blue, Procion Red, presentano delle somiglianze strutturali con cofattori di enzimi quali il NAD+ e NADP+: questa caratteristica permette di legare per affinità diverse classi di proteine

6 LIGANDI SPECIFICI: la molecola legata alla matrice è specifica per una proteina ESEMPIO ESEMPIO: analogo di un substrato per purificare un enzima, nickel per code di His L’anello imidazolico della catena laterale dell’istidina stabilisce legami di coordinazione con ioni divalenti dei metalli di transizione

Legame di un ligando al braccio spaziatore legato alla matrice L’immobilizzazione del ligando può causarne l’inattivazione perché si altera la sua struttura tridimensionale o perché il sito di legame non è più accessibile

ELUIZIONE NON SPECIFICA: Si cambia pH, forza ionica o si aggiunge un denaturanteSPECIFICA: Si aggiunge un competitore del substrato che presenta una maggiore affinità per l’enzima da purificare rispetto all’analogo che è legato covalentemente alla matrice

CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’ per purificare una RNasi Analogo del substrato legato covalentemente alla resina pirimidina

+ competitore o acido acetico pH 3

PURIFICAZIONE DI PROTEINE DI FUSIONE

CROMATOGRAFIA PER IMMUNOAFFINITA’

PURIFICAZIONE DI ANTICORPI

IMMUNOPRECIPITAZIONE

AFFINITA’ VANTAGGI: Grande capacità di carico (grandi volumi) La proteina è eluita in un piccolo volume Altamente specifica SVANTAGGI: Esecuzione in più tempi Si devono conoscere le caratteristiche della proteina (meccanismo d’azione, affinità per altre molecole, etc.) Eluizione in un tampone a pH e/o forza ionica diverso dal tampone iniziale Costi Inattivazione del ligando Contaminazione dell’agente “spiazzante”