La degradazione automatica di Edman Titolo del seminario con una visione del tutto 1

La degradazione automatica di Edman permette di identificare il residuo N-terminale di una proteina e si basa sulla reazione messa a punto da P. Edman circa 60 anni fa con il fenilisotiocianato N C S

Determinazione della sequenza N-Terminale DEGRADAZIONE DI EDMAN

PTH-aa standard hplc hplc

feniltioidantoina (PTH) Condizioni blande acide Degradazione di Edman feniltiocarbamile (PTC) feniltioidantoina (PTH) derivato tiazolinico N H NH 3 R R' O S + Analisi tramite RP-HPLC Condizioni blande acide in acqua C 23 Condizioni basiche TFA 100% anidro idrolisi anidra conversione PITC 5

Restrizioni dovute alla Degradazione di Edman Se l'amminoterminale è bloccato il peptide non può essere sequenziato con la degradazione di Edman (formilazione, piroglutammico ecc) Amminoacidi glicosilati e fosforilati possono dare "cicli bianchi", cioè con assenza di PTH-amminoacidi conosciuti Le cisteine…

I campioni devono essere: liberi da sali, da ammine primarie e detergenti sciolti in un solvente volatile come acqua, acetonitrile o in forma liofilizzata alternativamente possono essere trasferiti con elettroblotting su membrana PVDF (polivinilidene difluoruro)

Utilizzo della Degradazione automatica di Edman Determinazione della struttura primaria di una proteina Riconoscimento di proteine in modo diretto dopo cromatografie e/o elettroforesi Studio di modifiche post-traduzionali

La struttura primaria delle proteine fornisce informazioni sulla funzione di proteine per omologia fornisce informazioni su residui conservati ed indispensabili per le proprietà catalitiche di enzimi fornisce informazioni per comprendere a livello molecolare malattie ereditarie e metaboliche fornisce informazioni su modifiche post-traduzionali

È possibile determinare la struttura primaria di un’intera proteina effettuando di seguito un numero di cicli di degradazione di Edman opportuni? NO! La reazione di Edman non presenta una resa del 100%: per ogni ciclo si accumulano prodotti secondari (si arriva al massimo a determinare una successione 50/60 aa)

Strategia per la determinazione dell’intera struttura primaria della proteina Poiché la maggior parte delle proteine presenta un numero di residui maggiore di 50/60 unità, prima del sequenziamento devono essere frammentate con: Metodo enzimatico (peptidasi che permettono di ottenere peptidi di minore lunghezza, separati mediante RP-HPLC) oppure Metodo chimico (CnBr, specifico per le Met)

Reagente Sito di taglio Taglio chimico Bromuro di cianogeno Lato carbossilico di residui Met O-iodobenzoato Lato carbossilico di residui Trp Idrssilammina Legami Asp-Gly 2-Nitro-5-tiocianobenzoato Lato amminico di residui di Cis Taglio enzimatico Tripsina Lato carbos. di residui Lys e Arg Clostripaina Lato carbos. di residui Arg Proteasi dello Stafilococco Lato carbos. di residui Asn e Gln

Principali tipi di endopeptidasi Enzima Fonte Specificità Punti addizionali Tripsina Pancreas bovino taglia al C-terminale del legame peptidico di R e K, ma non se seguiti da P. alta specificità per i residui con carica positiva. Chimotripsina taglia al C-terminale del legame peptidico di F, Y, W, ma non se seguiti da P. preferisce voluminosi residui idrofobici; taglia lentamente anche a N, H, M e L. Thermolisina Bacillus thermoproteolyticus taglia all’N-terminale di I, M, F, W, Y, V ma non se seguiti da una P preferisce residui piccoli e neutri; può tagliare anche a A, D, H e T. Asp-N Proteina ingegnerizzata da Pseudomonas fragi taglia all’N-terminale del legame peptidico di D e dell’acido cisteico. provoca tagli addizionali in corrispondenza dei residui di E. Endopeptidasi V8 Staphylococcus aureus taglia al C-terminale del legame peptidico di E e di D. la specificità per D o E può variare con l’utilizzo di tamponi differenti.

Rappresentazione schematica della determinazione della sequenza di una proteina: il procedimento della sovrapposizione

Sequenza della catena A della Volkensina, una Ribosome Inactivating Proteins, estratta dalle radici di Adenia volkensii. Chambery A. et al., Eur J Biochem. 2004 Jan;271(1):108-17.

Utilizzo della Degradazione automatica di Edman Determinazione della struttura primaria di una proteina; Riconoscimento di proteine in modo diretto dopo cromatografie e/o elettroforesi;

Riconoscimento in modo diretto dopo cromatografie e/o elettroforesi di proteine separate mediante un passaggio di purificazione a seguito del quale la proteina risulta pura; di proteine non pure ma separabili tramite SDS-PAGE e successivo elettroblotting; di proteine separate tramite 2D-PAGE e successivo elettroblotting;

Determinazione della sequenza N-terminale di una proteina dopo SDS-PAGE Proteina Sequenza N-terminale mediante degradazione di Edman Separazione elettroforetica mediante SDS-PAGE Elettroblotting e colorazione con Rosso Ponceau

Informazioni di sequenza immediatamente dopo 2D-PAGE e elettroblotting Peso molecolare Elettroblot su apposita membrana pH Taglio dello spot Sequenziatore di proteine

Sensibilità : >250 fmoli (….) Tempo: informazioni in 15 ore. In alcuni casi si possono determinare anche 30-40 aa. Identificazione con analisi in banche dati. Blast, Tblast, Fasta and TFASTa Numero minimo di amminoacidi utili per l’analisi: 10/15 Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value gi|3914462|sp|O42897|PSD3_SCHPO PROBABLE 26S PROTEASOME REG... 16 67872 gi|9631161|ref|NP_047943.1| gp52 [Bacteriophage phi-C31] >g... 16 67872 gi|2496437|sp|P75153|Y43C_MYCPN HYPOTHETICAL LIPOPROTEIN MG... 16 67872 gi|7441762|pir||G01747 albumin homolog - human (fragment) >... 16 115771 gi|4585307|gb|AAD25372.1|AF119821_1 (AF119821) attractin [M... 15 129035 gi|6912258|ref|NP_036202.1| attractin; attractin (with dipe... 15 129035 gi|7594623|emb|CAB88109.1| (AL132773) dJ741H3.1.1 (attracti... 15 129035 gi|12275312|dbj|BAB21018.1| (AB038388) attractin [Rattus no... 15 129035 gi|8118083|gb|AAF72882.1|AAF72882 (AF218915) secreted attra... 15 129035 gi|7708392|emb|CAB90108.1| (AL132773) dJ741H3.1.2 (KIAA0548... 15 129035 gi|4093196|gb|AAD03057.1| (AF106861) attractin-2 [Homo sapi... 15 129035 gi|6753146|ref|NP_033860.1| attractin [Mus musculus] >gi|44... 15 129035 gi|12742385|ref|XP_009552.2| attractin [Homo sapiens] 15 129035 gi|12275308|dbj|BAB21017.1| (AB038387) attractin [Rattus no... 15 129035 gi|8118082|gb|AAF72881.1|AAF72881 (AF218915) membrane attra... 15 129035 gi|7573540|emb|CAB87588.1| (AL121965) dJ161I14.1 (RNA helic... 15 132306 gi|12061185|gb|AAG45474.1| (AY013288) ASC-1 complex subunit... 15 132306 gi|2842424|emb|CAA11679.1| (AJ223948) RNA helicase [Homo sa... 15 132306 gi|12730688|ref|XP_003499.2| albumin precursor [Homo sapiens] 15 139098 gi|28590|emb|CAA23753.1| (V00494) reading frame HSA [Homo s... 15 140264 gi|6013427|gb|AAF01333.1|AF190168_1 (AF190168) serum albumi... 15 140264 gi|28592|emb|CAA23754.1| (V00495) serum albumin [Homo sapiens] 15 141439 gi|2500992|sp|P77892|SYGA_MORCA GLYCYL-TRNA SYNTHETASE ALPH... 15 141439 gi|4502027|ref|NP_000468.1| albumin precursor; PRO0883 prot... 15 142624 gi|7460098|pir||T05076 hypothetical protein T6K21.80 - Arab... 15 143819 6 aa >100 proteine DAHKSE Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value gi|7441762|pir||G01747 albumin homolog - human (fragment) >... 25 154 gi|6013427|gb|AAF01333.1|AF190168_1 (AF190168) serum albumi... 25 158 gi|28590|emb|CAA23753.1| (V00494) reading frame HSA [Homo s... 25 160 gi|4502027|ref|NP_000468.1| albumin precursor; PRO0883 prot... 25 161 gi|28592|emb|CAA23754.1| (V00495) serum albumin [Homo sapiens] 25 161 gi|12730688|ref|XP_003499.2| albumin precursor [Homo sapiens] 25 167 gi|178345|gb|AAA98798.1| (M12523) alloalbumin Venezia [Homo... 25 173 gi|11513969|pdb|1E7E|A Chain A, Human Serum Albumin Complex... 25 186 gi|229552|prf||754920A albumin [Bos taurus] 24 260 gi|418694|pir||ABBOS serum albumin precursor [validated] - ... 24 348 gi|113580|sp|P02770|ALBU_RAT SERUM ALBUMIN PRECURSOR >gi|72... 24 351 gi|2190337|emb|CAA41735.1| (X58989) serum albumin [Bos taur... 24 375 gi|1351907|sp|P02769|ALBU_BOVIN SERUM ALBUMIN PRECURSOR >gi... 24 385 gi|113582|sp|P14639|ALBU_SHEEP SERUM ALBUMIN PRECURSOR >gi|... 23 436 gi|2492797|sp|Q28522|ALBU_MACMU SERUM ALBUMIN PRECURSOR >gi... 23 482 gi|543794|sp|P35747|ALBU_HORSE SERUM ALBUMIN PRECURSOR >gi|... 23 584 11 aa DAHKSEVAHR

Prima proteina sequenziata   Sanger F., Tuppy H. (1951) “The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin 2. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates.” Biochem. J. 49:481-490 Si dimostró che la sequenza era costituita solo da L-amminoacidi uniti tra loro da legami peptidici fra i gruppi a-amminici e i gruppi a-carbossilici