III ESERCITAZIONE: PURIFICAZIONE DI IgG da una miscela proteica
Cellule eucariotiche contenenti IgG Lisi mediante detergenti Omogenato cellulare Centrifugazione (eliminazione detriti cellulari) Sopranatante dell’omogenato cellulare contenente le IgG
Cromatografia per immunoprecipitazione Sopranatante dell’omogenato cellulare Cromatografia per immunoprecipitazione Resina: proteina A-sefarosio
Volume della resina: circa 60 µl CONDIZIONI SPERIMENTALI Volume della resina: circa 60 µl Tampone di equilibramento: TrisHCl 0.1 M, pH 8.0 Tampone di eluizione Gly-HCl 0.1M, pH 2.7 Campione di carico: lisato cellulare Volume del campione di carico= 0,3 ml
PROCEDURA SPERIMENTALE La resina proteina A-sefarosio è incubata con il lisato cellulare, contenente l’anticorpo da purificare, per 1h, r.t. 2000 g per 5 min per raccogliere il materiale non legato. 8 lavaggi della resina con 0.2 ml di Tris-HCl 0.1 M, pH8 per allontanare tutto il materiale legato in maniera aspecifica alla resina (lettura a 280nm). Eluizione incubando la resina per 5 min con 60 µl di Gly-HCl 0.1M, pH 2.7. L’eluato è recuperato la resina per 5 min a 2000 xg.
IV ESERCITAZIONE Separazione elettroforetica di proteine su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti
(il rapporto CARICA/MASSA è uguale per tutte le proteine) Nella SDS-PAGE la velocità di migrazione è proporzionale alle dimensioni della proteina (il rapporto CARICA/MASSA è uguale per tutte le proteine) - +
- +
(molto idrofilico => Trattiene grosse quantità di acqua) + TEMED (catalizzatore della reazione) GEL di POLIACRILAMMIDE (molto idrofilico => Trattiene grosse quantità di acqua)
Gel Separatore (Resolving) pH 8.8 Gel Impaccatore (Stacking) pH 6.8 (6% di Acrilammide) Gel Separatore (Resolving) pH 8.8 Dal 12% al 18% di Acrilammide
Xilene cianolo Blu di bromofenolo
Xilene cianolo Blu di bromofenolo
Al termine della corsa elettroforetica il gel è colorato con una soluzione contenente acido acetico e blu di coomassie L’eccesso di colorante viene eliminato decolorando il gel con una soluzione di etanolo-acido acetico