ONCOLOGIA SPERIMENTALE DI LABORATORIO S.BENINATI

E’ un processo attraverso il quale è possibile inserire del DNA esogeno, transgene, all'interno di cellule vegetali o animali L’animale si definisce transgenico quando il gene esterno è: integrato nel suo genoma espresso correttamente e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale integrato nella linea germinale e per conseguenza trasmissibile dall’animale fondatore alla progenie. Transgenesi S.Beninati

PERCHE CREARE ANIMALI TRANSGENICI? Per il miglioramento delle prestazioni produttive degli animali Per il miglioramento della qualità dei prodotti Per aumentare la resistenza degli animali alle malattie Per la produzione di proteine di importanza farmaceutica Per creare modelli animali per lo studio delle malattie nell’uomo Per fornire organi per xenotrapianti nell’uomo S.Beninati

COME SI OTTENGONO? Metodi per l'inserimento del DNA esogeno in cellule animali sono: Metodi per l'inserimento del DNA esogeno in cellule animali sono: Microiniezione di DNA ricombinante nel pronucleo maschile dello zigote La microiniezione di cellule staminale nell’ovocita fertilizzato Trasferimento del nucleo di cellule staminali trasformate in vitro in oociti anucleati Transgenesi mediata da retrovirus Transgenesi mediata da spermatozoi S.Beninati

Microiniezione di DNA Con questo sistema circa il 10% degli animali nati è transgenico. Ovulo fertilizzato Ovulo fertilizzato Pronucleo femminile Pronucleo maschile Pipetta di fissaggio Pipetta di iniezione Transgene Femmina che ha subito l’impianto Fondatore transgenico Solo sul topo da buoni risultati. Si fa una microiniezione di DNA ricombinante nel pronucleomaschile dello zigote Prelevamento degli zigoti della femmina con microiniezione del transgene Impianto degli embrioni a due cellule in una pseudo-madre sottoposta a trattamento ormonale S.Beninati

Microiniezione di cellule staminali Utilizzo di cellule staminali ricavate dalla blastociste murine Coltivazione di queste e successiva transfettazione con il gene di interesse Reintroduzione cellule per microiniezione in blastociste derivate da un altro topo, Sviluppo di embrioni parzialmente transgenici,e loro introduzione in madri pseudogravide Identificazione di un animale nel quale il transgene sia presente nella linea germinale Fondatore transgenico Impianto Blastocisti ricevente Microiniezione nella blastocisti Arricchimento in cellule ES transfettate Cellule ES Transfezione Transgene Cellule ES Blastocisti donatrice Massa cellulare interna Coltura S.Beninati

Trasferimento del nucleo di cellule staminali Prevede l'utilizzo della tecnica di clonazione Coltivazione di cellule staminali e successiva transfettazione con il gene di interesse Microiniezione dei nuclei delle cellule in un ovocita anucleato L’introduzione del nucleo darà origine a un embrione, che è poi impiantato in una madre pseudogravida Si ottiene un animale transgenico nel cento per cento dei casi Efficienza estremamente bassa Transfezione I.C.M. Neo Esone Introne Selezione cellule Pipetta Nucleo Ovulo Enucleazione Nuclei purificati Fusione attivazione Coltura embrione in vitro Impianto Topo transgenico S.Beninati

Transgenesi mediata da retrovirus Gli embrioni vengono infettati con un retrovirus reso non patogeno e con alcune delle sue componenti sostituite con il gene di interesse L'embrione infettato viene quindi impiantato nella madre che darà poi origine alla prole Rischi: Possibilità di generare nuovi virus patogeni Reazioni immunitarie Femmina donatrice Embrione a 8 cellule Retrovirus Transgene Femmina che ha subito l’impianto Fondatore transgenico S.Beninati

Transgenesi mediata da spermatozoi Gli spermatozoi si legano spontaneamente con molecole di DNA esogeno e lo trasferiscono agli embrioni durante la fecondazione La prole è poi selezionata sulla base dell’analisi del DNA estratto da un frammento di coda o di orecchio. Questo metodo è stato associato all’ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection) Con questo sistema sono stati ottenuti topi transgenici ad alta efficienza. S.Beninati

Transgenesi mediata da spermatozoi Interazione spermatozoi/DNA Fecondazione esterna Sviluppo esterno Progenie transgenica Fecondazione in vitro Impianto embrioni 2 cellule in pseudogravide Interazione spermatozoi/DNA Fecondazione artificiale S.Beninati

Esperienza molto limitata di trapianti xenogenici di organi o tessuti in riceventi umani : Anni ‘70: sopravvivenza per nove mesi di un rene di scimpanzé trapiantato in un ricevente umano Anni ‘70: sopravvivenza per nove mesi di un rene di scimpanzé trapiantato in un ricevente umano Anni ‘80: trapianto di un cuore di babbuino in una bambina che sopravvisse per poche settimane Anni ‘80: trapianto di un cuore di babbuino in una bambina che sopravvisse per poche settimane Anni ‘90: due fegati di babbuino furono trapiantati in due pazienti: sopravvissero l'uno per settanta giorni e l'altro per ventisei giorni Anni ‘90: due fegati di babbuino furono trapiantati in due pazienti: sopravvissero l'uno per settanta giorni e l'altro per ventisei giorni Tentati trapianti di cuore (tre casi) o di fegato (un caso) di maiale; in nessun caso il paziente sopravvisse più di ventiquattro ore. Tentati trapianti di cuore (tre casi) o di fegato (un caso) di maiale; in nessun caso il paziente sopravvisse più di ventiquattro ore.Xenotrapianti S.Beninati

Xenotrapianti Rigetto cronico dello xenotrapianto ( proliferazione cellule muscolari lisce obliterazione vasi sanguigni) Rigetto cronico dello xenotrapianto ( proliferazione cellule muscolari lisce obliterazione vasi sanguigni) Sono 4 gli ostacoli immunologici da superare: Rigetto iperacuto ( ant. xenoreattivi vs cellule endoteliali) Rigetto acuto vascolare (ant. Xenoreativi + natural killer + monociti att. Cellule endoteliali infiamamzione, trombosi e rigetto) Rigetto mediato dalle cellule T S.Beninati

Trasmissione di agenti infettivi Non si puo esculdere presenza di virus che non provocano alcuna patalogia nel maiale ma patogeni per l’uomo Identificati oltre 60 agenti infettivi del maiale, con la potenziale capacità di causare malattie nell'uomo Adottate misure di controllo: parto dei maiali mediante isterotomia controllo accurato dell'ambiente sorveglianza routinaria dei maiali e del personale che li cura Esclusi quasi tutti gli agenti infettivi noti, che destano preoccupazione S.Beninati

ASPETTI ANTROPOLOGICI ED ETICI In aggiunta ai problemi connessi ci sono tre questioni che richiedano di essere affrontate: L'accettabilità dell'intervento dell'uomo sull'ordine del creato La praticabilità etica di tale tecnica L'eventuale impatto sulla psiche umana S.Beninati

L'accettabilità dell'intervento dell'uomo sull'ordine del creato Questo non vuol dire che l’uomo deve spadroneggiare sulle altre creature ma le deve orientare verso l’autentico e integrale bene dell’uomo Posizione della Chiesa cattolica: Uomo al centro e al culmine del creato collabora con il Creatore per raggiungere la perfezione finale del creato Quindi Dio affida all’uomo il dominio del creato in Suo nome L’uomo riflette l’azione stessa del Creatore dell’universo S.Beninati

La praticabilità etica di tale tecnica Sono 2 i problemi di natura etica Sono 2 i problemi di natura etica Uso degli animali per migliorare la sopravvivenza dell'uomo Accettabilità del superamento della barriera tra specie animale e specie uomo l'animale e l'uomo abbiano una dignità equivalente animali siano del tutto in balia dell'arbitrio umano Uomo tiranno Nessuna limitazione etica Identita personale non viene intaccata Rispetto esigenze etiche Rimane solo l’aspetto culturale psicologico S.Beninati

L'eventuale impatto sulla psiche umana L'identità personale e’ la singolarità e irriducibilità dell'uomo in rapporto al suo essere e al suo sentirsi persona Allora l'identità personale costituisce un bene della persona Limite etico nel caso che esso eventualmente comportasse modifiche per l'identità della persona che lo riceve. Avremo 2 tipi di organi: quelli meramente funzionali e quelli con maggiore valenza personalizzante Questi dovranno essere valutati, caso per caso, proprio in funzione della carica simbolica che vengono ad assumere nella singola persona S.Beninati