ISTONI E NUCLEOSOMI

ISTONI E NUCLEOSOMI

ISTONI E NUCLEOSOMI

ISTONI E NUCLEOSOMI

CODICE ISTONICO

ACETILASI ISTONICHE (HAT)

DE-ACETILASI ISTONICHE (HDAC)

RECETTORI DEGLI ORMONI TIROIDEI

RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA

CODICE ISTONICO

Definizioni e Background La trascrizione dei geni codificanti proteine è attuata dall’RNA polimerasi II, grazie all’azione concertata di molteplici fattori proteici. I fattori basali garantiscono il posizionamento dell’RNA polimerasi sul sito di inizio della trascrizione (TFII-A, -B, -D, -F, Mediatore) e l’evasione dal promotore (TFII-E, -H); gli attivatori della trascrizione, attraverso vari meccanismi, fanno sì che il processo proceda ripetutamente, per generare numerose copie di trascritti, a partire dai due soli stampi disponibili (in un genoma diploide) di ciascun gene. È altresì ovvio che la trascrizione richieda l’adeguata esposizione di regioni regolatrici sul DNA (promotori ed enhancer), e delle loro interazioni funzionali. In questo approfondimento analizzeremo gli eventi richiesti per promuovere la trascrizione in cellule eucariotiche complesse, sfruttando l’esempio del gene dell’interferone beta, attivato dall’infezione virale. Ci renderemo anche conto di come modifiche della struttura della cromatina in punti chiave sia alla base di questi meccanismi. Lo schema mostra l’RNA polimorasi II, guidata sul promotore dai fattori basali e dal Mediatore. Gli attivatori, legando il Mediatore e/o alcuni fattori basali, favoriranno il reclutamento di un altro complesso di Pol II, una volta che quella rappresentata in Figura avrà iniziato a trascrivere lo stampo. Nota la fusione delo stampo a livello del promotore, indice della formazione del Complesso di preinizio. Immagine tratta da Biologia Molecolare del Gene, Watson et al. (6a Edizione), Zanichelli (Fig. 12.18).

L’interferone beta Nei mammiferi, gli interferoni costituiscono la prima linea di difesa nei confronti dell’infezione da virus. Queste citochine bloccano la diffusione dell’infezione virale nell’organismo, talvolta, anche attraverso il “sacrificio” delle cellule infettate. L’interferone beta (IFN-), è un interferone di tipo I, ed è espresso da svariati tipi cellulari, mentre IFN- un altro interferone di tipo I, è principalmente espresso da cellule emopoietiche. Gli interferoni, legandosi a recettori sulla superficie cellulare, inducono una serie di risposte atte a contrastare l’infezione virale. Tra queste, la risposta mediata da interferone è un meccanismo generale che promuove la degradazione di mRNA ed interferisce con la sintesi proteica nelle cellule infettate. In effetti, risposte mediate da interferone si osservano anche in cellule trattate con RNA a doppio filamento in corso di RNA interference, un metodo ampiamente sfruttato nella ricerca biomedica per inibire selettivamente l’espressione di specifici geni. Per le loro caratteristiche, interferoni prodotti con le tecnologie del DNA ricombinante sono spesso utilizzati nella terapia di malattie virali (epatite C) ed autoimmuni (sclerosi multipla). L’immagine, tratta dal lavoro di Karpusas et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 October 28; 94(22): 11813–11818.), mostra un dimero di IFN-, in cui un atomo di zinco all’interfaccia tra le due molecole, interagendo con un residuo di istidina sulla molecola A (His-121) e con His-93 e His-97sulla molecola B, stabilizza la struttura dimerica. Ciascun monomero è formato da 5 regioni ad -elica (A-E). La subunità superiore è glicosilata, ed alla sua sommità si evidenzia uno zucchero in conformazione estesa, legato al residuo Asn-80.

Il gene dell’interferone beta Il gene dell’IFN- è uno dei pochi geni eucariotici “intron-less”, cioè, privo di introni. La sua trascrizione è controllata da un enhancer, cui si legano, in maniera cooperativa, diversi attivatori della trascrizione. L’enhancer del gene dell’IFN-è localizzato in posizione strategica (posizioni -110/-48), immediatamente a monte del promotore del gene; quest’ultimo è normalmente “coperto” da un nucleosoma (posizioni - 15/+132, ricoperte dal rettangolo). La freccia in corrispondenza della posizione +1 indica il sito di inizio della trascrizione; il riquadro arancione indica la posizione della TATA box . Sull’unico esone del gene sono evidenziate le posizioni (non in scala) del codone di inizio (ATG) e di stop della traduzione. Come potrà partire la trascrizione del gene dell’IFN- se il suo promotore è, in condizioni basali, “occupato” dall’ottamero istonico? +1 nucleosoma ATG stop Enhancer TATA -110 -48 -15 +132

Assemblaggio dell’enhanceosoma sul gene dell’interferone beta Il primo passo nell’attivazione del gene dell’IFN- parte dall’enhancer, su cui si assemblano fattori trascrizionali per costituire l’enhanceosoma. In primis, il fattore architetturale HMG I(Y), interagendo con il DNA dell’enhancer, lo distorce, permettendo il legame cooperativo degli attivatori IRF-1, ATF-2/c-Jun ed NFkB (eterodimero p50/p65). Cosa intendiamo per legame cooperativo di attivatori diversi ? La logica generale di molti meccanismi biologici, compresa l’attivazione trascrizionale, è che più eventi in successione ordinata siano richiesti per avviare e sostenere il processo (nel nostro caso, l’espressione di un gene). Ciascuno degli eventi (es., legame di HMG I) prelude, e facilita, il successivo evento (legame del secondo attivatore). Nel nostro caso, il secondo fattore non potrà legarsi efficientemente al DNA dell’enhancer, se quest’ultimo non sia stato opportunamente “ripiegato” dal fattore architetturale HMG I. E così via, il terzo fattore potrà legarsi all’enhancer, solo in presenza dei primi due. Ricorda che, come discusso a lezione, una logica simile è quella che viene sfruttata dai fattori basali della trascrizione per l’assemblaggio del complesso di inizio (in questo caso, sui promotori provvisti di TATA box, TBP distorce il DNA e favorisce il reclutamento degli altri fattori). Immagine tratta da Biologia Molecolare, Weaver (2a Edizione), McGraw-Hill (Fig. 10.22).

Cronologia di eventi per l’attivazione del gene IFN beta La logica degli eventi cooperativi appena descritta ci consente di comprendere anche gli eventi successivi all’assemblaggio dell’enhanceosoma (tappa (a) nello schema a lato), che in definitiva permetteranno la trascrizione del gene. Questi processi, infatti, guideranno una serie di modifiche mirate sul nucleosoma centrato tra le posizioni -15 e +132 del gene. Ad esempio, nella tappa (b), l’acetilasi istonica GCN5 è reclutata dai fattori dell’enhanceosoma (evidentemente, grazie ai rispettivi domìni di attivazione); questa acetila gli istoni H3 ed H4 in punti “strategici”: lisina 9 (K9) di H3 e K8 di H4. Nella tappa (c), una chinasi non identificata fosforila la serina 10 (S10) di H3, e probabilmente la stessa GCN5 acetila K14 di H3. La specifica combinazione di eventi così realizzati comporta l’attuazione del codice istonico sul nucleosoma che “protegge” il promotore basale del gene dell’ IFN- Immagine tratta da Biologia Molecolare, Weaver (2a Edizione), McGraw-Hill (Fig. 11.29).

Cronologia di eventi per l’attivazione del gene IFN beta In che modo viene interpretato questo specifico schema di modifiche sul nucleosoma? Ricorda che, come detto a lezione, i residui di lisina acetilati sugli istoni possono essere riconosciuti da proteine che possiedono bromodomìni. Nel caso specifico, il complesso di rimodellamento della cromatina SWI/SNF si lega a K8 acetilata di H4 attraverso il bromodominio della sua subunità BRG1, rendendo possibile l’esposizione di sequenze necessarie alla formazione del complesso basale di trascrizione (tappa (d)). Infine, la subunità TAFII250 di TFIID, che possiede due bromodomìni, si lega a K9 e K14 acetilate di H3 (tappa (e)). Nota che, oltre all’interazione dei bromodomìni di TAFII250 con le lisine acetilate di H3, il fattore generale TFIID è stabilizzato sulla cromatina anche grazie al legame della sua subunità TBP alla TATA box. Immagine tratta da Biologia Molecolare, Weaver (2a Edizione), McGraw-Hill (Fig. 11.29).

Immuno-precipitazione della cromatina (ChIP) Ma come si è giunti alla definizione di questo complesso meccanismo molecolare? Una tecnica analitica molto sfruttata per “decifrare” gli eventi che coinvolgono sequenze specifiche di DNA (nel nostro caso la regione - 15+132) e le proteine associate (sempre nel nostro caso, gli istoni modificati del nucleosoma) è quella della Immuno-precipitazione della cromatina (ChIP). Disponendo, infatti, di anticorpi in grado di riconoscere le più comuni modificazioni istoniche, si può valutare se gli istoni associati ad una specifica regione del genoma sono modificati ad opera di acetilasi. Immagina che la proteina legata al DNA nella figura a lato corrisponda all’istone H3, e che la sferetta gialla rappresenti la lisina 9 acetilata: un anticorpo (nella Figura, a forma di Y) riconosce e lega la lisina 9 acetilata (e non altre) e sequestra (immuno-precipita) il complesso con il frammento di DNA associato. Quest’ultimo è riconosciuto ed amplificato mediante PCR. Immagine tratta da Biologia Molecolare, Weaver (2a Edizione), McGraw-Hill (Fig. 11.26).

Conclusioni mmaginate il destino di cellule in cui, in assenza di infezione virale, non fosse garantita la repressione del gene IFN- In maniera complementare, immaginate le sorti di un tessuto in cui, a seguito di infezione virale, la trascrizione del gene non si attivasse ai giusti livelli nelle cellule infettate. Quindi, l’enhanceosoma ha guidato eventi di acetilazione e fosforilazione su H3 e H4 (codice istonico), per l’esposizione del promotore basale, mediata dal complesso di rimodellamento SWI/SNF. Ciò permette il reclutamento dei fattori basali sul promotore (nell’esempio, TFIID), che vi guideranno l’RNA polimerasi II per la formazione del complesso aperto e l’inizio della trascrizione del gene dell’IFN-. In definitiva, questa successione di eventi garantisce un controllo molto efficace della trascrizione del gene dell’IFN- in cellule non infettate (promotore basale “bloccato” dal nucleosoma), oltre ad un adeguato livello di espressione in cellule infettate da virus (promotore basale accessibile e costantemente legato da TFIID per il continuo reclutamento di RNA polimerasi II). In effetti, all’ordinato susseguirsi degli eventi molecolari descritti, la soglia per consentire la trascrizione del gene dell’IFN-, inizialmente molto alta, viene raggiunta non senza difficoltà (pensa alla numerosità e complessità degli eventi richiesti), quindi inesorabilmente superata.

Materiali di studio Per una trattazione adeguata dell’argomento si veda: Weaver, Biologia Molecolare (2a Edizione, 2009), McGraw-Hill; Watson–Baker–Bell-Gann-Levine-Losick, Biologia Molecolare del Gene (6a Edizione, 2009), Zanichelli. Per la letteratura originale si consulti: Agalioti T, Chen G, Thanos D. Deciphering the transcriptional histone acetylation code for a human gene. Cell. 2002 Nov 1;111(3):381-92. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12419248 Munshi N, Agalioti T, Lomvardas S, Merika M, Chen G, Thanos D. Coordination of a transcriptional switch by HMGI(Y) acetylation. Science. 2001 Aug 10;293(5532):1133-6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11498590 Agalioti T, Lomvardas S, Parekh B, Yie J, Maniatis T, Thanos D. Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-beta promoter. Cell. 2000 Nov 10;103(4):667-78. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11106736

IMMUNO-PRECIPITAZIONE DELLA CROMATINA