Approccio top down per la sovrapposizione di cloni contenenti marcatori genetici yM1 ed yM2 si sovrappongono? clone yM1 Si isola un ’ estremità del clone M1, si marca e si utilizza come sonda sul clone M2 digerito e trasferito su un filtro Estrazione, restrizione ed elettroforesi del clone M2 Risultato dell ’ ibridazione L ’ ibridazione dimostra che l ’ estremità del clone M1 è presente nel clone M2 Risultato dopo analisi della genoteca in YAC con 7 marcatori polimorfici (M1-M7) M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 contig Intervallo non coperto da cloni Megabasi Contig completo che comprende l ’ intera regione M1-M7 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Si usa il marcatore M1 come sonda di ibridazione per analizzare una genoteca in YAC Si usa il marcatore M2 come sonda di ibridazione per analizzare una genoteca in YAC sonda M1 sonda M2 clone yM1 clone yM2 Questo tipo di approccio permette di ottenere cloni associati a marcatori già mappati in regioni vicine tra loro

Approccio (dal basso) bottom up: per la sovrapposizione di cloni ottenuti a caso Genoma umano aploide 1) Digerire con enzimi di restrizione e clonare in cosmidi per ottenere una genoteca cosmidica Contig lungo un intero cromosoma 4) Ordinare tutti i cloni cosmidici ottenuti in 24 contig mediante FISH 3) Inserire i dati della mappe di restrizione in un computer per ottenere le sovrapposizioni Clone 1Clone 3 Clone 2 Clone 4 Questo tipo di approccio permette di ottenere cloni ordinati in “ contig ” partendo da cloni “ a caso ” privi di informazioni sulla loro localizzazione ,5 3 2, ) Tipizzare ciascun cosmide mediante mappe di restrizione 4532, ,5 6 Clone 1 Clone 2 Clone 1 Clone2

Cromosoma 17 intero milioni di coppie di basi Segmento 17Q21 due milioni di coppie di basi Segmento 17Q21 di coppie di basi BAC coppie di basi Gene BRCA coppie di basi 17Q21 BAC 283 BRCA1 Mappa fisica del cromosoma 17 umano

YAC geni STS Bande cromosomiche YAC geni STS Bande cromosomiche PSEUDOAUTOSOMALE Mappa fisica del cromosoma Y umano Sequenze omologhe X-Y Sequenze ripetute dell ’ Y

Studio delle variazioni interindividuali nella sequenza del DNA in relazione alla risposta ai farmaci (Organo Europeo di Valutazione dei Farmaci) Obiettivo ultimo della FARMACOGENETICA e’ di predire e quindi di prevenire reazioni avverse e fallimenti terapeutici, ma anche di favorire l’identificazione del farmaco giusto e del suo corretto dosaggio per ogni singolo individuo Definizione di “Farmacogenetica”

risposte avverse a farmaciADR (O.M.S.1970) Le risposte avverse a farmaci o ADR sono reazioni indesiderate dannose e inattese, anche gravi, che sopravvengono in seguito alla somministrazione di un farmaco, alle dosi comunemente usate per motivi terapeutici, diagnostici o preventivi (O.M.S.1970) aumento delle reazioni avverse a farmaci Negli ultimi anni si è assistito ad un aumento delle reazioni avverse a farmaci dovuto principalmente al crescente consumo di farmaci e alla continua introduzione sul mercato di molecole farmacologicamente attive, di nuova sintesi e chimicamente diverse Risposte Avverse a Farmaci È molto difficile accertare le ADR per: rapporto sicuro causa-effetto difficoltà di stabilire un rapporto sicuro causa-effetto tra assunzione farmacologica e manifestazione clinica; discriminare i sintomidifficoltà nel discriminare i sintomi dovuti alla malattia in atto dai sintomi conseguenti alla terapia praticata, specie in caso di assunzioni multiple fenomeno spesso sottovalutato non compresoperchè è un fenomeno spesso sottovalutato e/o non compreso Sono la quarta causa di morte dopo malattie cardiovascolari, tumori e ictus

Variabilità individuale nella risposta a farmaci PAZIENTI con la stessa diagnosi RISPONDERÀ BENE Gruppo che RISPONDERÀ BENE al farmaco RISPONDERÀ POCO o NON RISPONDERÀ Gruppo che RISPONDERÀ POCO o NON RISPONDERÀ affatto al farmaco -> (si potrà provare un farmaco diverso) RISPOSTA TOSSICA Gruppo che manifesterà una RISPOSTA TOSSICA al farmaco -> (si potrà diminuire la dose oppure provare un farmaco diverso) Variabilità individuale nella risposta a farmaci

Fisiologici età, sesso, peso corporeo Patologici malattie, livello di funzionalita’ epatica o renale Ambientali dieta, alcool, tabacco, altri farmaci Legati al paziente La FARMACOGENETICA è lo studio delle variazioni inter-individuali nella sequenza del DNA dei singoli individui in relazione alla risposta ai farmaci Fattori che influenzano la risposta individuale a farmaci Genetici: costituzione genetica Genetici: Una delle cause piu’ importanti delle differenze nella risposta ad un dato farmaco e’ la costituzione genetica degli individui

scoperta di farmaci e nuove terapie. Il principale obiettivo del progetto genoma era di avere informazioni su tutti i geni compresi quelli responsabili di malattie e di avere informazioni utili anche alla scoperta di farmaci e nuove terapie. “superfarmaci” Sarebbe sbagliato credere che il cammino verso la medicina del futuro sarà lastricato di nuovi “superfarmaci” per malattie oggi incurabili. MIGLIORAMENTO DELLE TERAPIE ESISTENTI, grazie alle crescenti conoscenze sui geni che controllano il metabolismo dei farmaci! Farmaci e nuove terapie

I primi studi di FARMACOGENETICA si sono concentrati su fenotipi di risposta ai farmaci a trasmissibilità mendeliana. Uno dei più importanti fenotipi descritti è relativo alla DEBRISOCHINA; è un farmaco antipertensivo che riduce la pressione ostacolando la normale liberazione fisiologica della noradrenalina dai neuroni simpatici postgangliari. La DEBRISOCHINA è trasportata attraverso la membrana dei nervi simpatici con lo stesso meccanismo che trasporta la NORADRENALINA. Dopo che è penetrata all’interno della cellula, si concentra nelle vescicole stesse del neurotrasmettitore rimpiazzando la noradrenalina. FARMACOCINETICA della DEBRISOCHINA: circa il 50% viene eliminato dal rene. Ha una emivita piuttosto lunga : 5 giorni. È simile alla GUANETIDINA (Farmaco anti-ipertensivo dotato di azione antiadrenergica). Inibisce infatti l'attività del sistema nervoso simpatico (farmaco SIMPATICOMIMETICO), riducendo la quantità di mediatore chimico (noradrenalina) liberato in corrispondenza delle terminazioni nervose dopo stimolazione delle fibre simpatiche; ha pure una modesta azione anestetica locale I primi anni della FARMACOGENETICA

Nel 1970 al St. Mary’s Hospital Medical School in Londra il gruppo di Robert Smith, cominciò a lavorare con la DEBRISOCHINA per studiarne il suo preciso metabolismo. Al programma parteciparono 5 ricercatori del gruppo di ricerca compreso il capo e quindi presero il farmaco. Dopo poche ore proprio Robert Smith, che aveva preso 40 mg di DEBRISOCHINA, si sentì “frizzante e disorientato” e poi è svenuto a causa di una ipotensione. Nella maggior parte delle persone la DEBRISOCHINA è metabolizzata ed eliminata attraverso le urine. Analizzando le urine di Smith queste non contenevano metaboliti di debrisochina. Le ricerche furono estese alla sua famiglia e alcuni membri avevano le stesse reazioni di Smith. Le ricerche furono in seguito estese alla popolazione formata dagli studenti di medicina. Seguendo questo fenotipo si è arrivati in seguito al clonaggio del gene interessato che è il primo responsabile del metabolismo della DEBRISOCHINA è cioè il CITOCROMO P450 IID polipeptide 6 (CYP2D6) ed alla caratterizzazione dei polimorfismi che eliminano la sua attività. Problemi al St. Mary’s Hospital di Londra

Componenti chiave della FARMACOGENETICA FARMACO BERSAGLIO DEL FARMACO TRASPORTATORI DEL FARMACO ENZIMI CHE METABOLIZZANO IL FARMACO FARMACODINAMICA (PD) (ciò che il FARMACO fa all ’ organismo) FARMACOCINETICA (PK) (ciò che l ’ organismo fa al FARMACO) Variabilità nella risposta al farmaco o nella sua tossicità

2. Geni codificanti per il bersaglio terapeutico del farmaco (FARMACODINAMICA) Recettori Canali ionici Enzimi Proteine regolatrici 1.Geni codificanti per proteine coinvolte nella biodisponibilità del farmaco (FARMACOCINETICA) Assorbimento Enzimi del metabolismo Trasportatori Escrezione Polimorfismi a questi livelli possono determinare modificazioni nella risposta ad un farmaco DI NATURA FARMACOCINETICA DI NATURA FARMACODINAMICA Producendo la comparsa di effetti avversi o assenza di risposta clinica Geni che influenzano la risposta al farmaco

I geni candidati per essere i RESPONSABILI delle risposte variabili ai farmaci oppure legati alla loro TOSSICITA’ sono i geni che codificano per enzimi che METABOLIZZANO i farmaci ed i loro prodotti. Il sito principale in cui questi enzimi svolgono la loro funzione è il fegato, anche se molti DMEs sono attivi anche in altri tessuti. Ad esempio alcuni DMEs sono parte integrante della barriera sangue-cervello. Aspetti nella FARMACOCINETICA responsabili della risposta variabile in diversi individui Gli enzimi rilevanti a questo scopo si chiamano Drug Metabolyzing Enzymes (DMEs) e si sono evoluti allo scopo di neutralizzare le xenotossine e/o per controllare le concentrazioni di molecole segnale in pathway endogeni. Oltre ai DMEs anche il TRASPORTO dei farmaci è un processo di ovvia importanza. I farmaci sono attivamente mossi dentro e fuori dai compartimenti da specifici TRASPORTATORI. Alterazioni nei geni di questi trasportatori producono variabilità. METABOLISMO

Farmaco LIPOSOLUBILE BIOTRASFORMAZIONE FEGATO Metabolita IDROFILICO GLOMERULI RENALI Metabolita ESCRETO Metabolita RITENUTO Biotrasformazione epatica  È il meccanismo principale per la regolazione della concentrazione del farmaco  Trasforma composti lipofilici in metaboliti più idrosolubili e facilmente eliminabili con l’urina  La trasformazione avviene a livello del reticolo endoplasmatico liscio dove sono localizzati i principali enzimi coinvolti nel metabolismo

Reazioni di Fase I: Ossidazione Riduzione Idrolisi Reazioni di Fase II: Acetilazione Metilazione Coniugazione con gruppi (Acido Glucuronico, Glutatione) ASSORBIMENTO METABOLISMO ELIMINAZIONE o attivazione Lipofilo Idrofilo alterazioni degli enzimi coinvolti nei processi metabolici La causa principale di molti effetti indesiderati nella risposta a farmaci, dipende da alterazioni degli enzimi coinvolti nei processi metabolici a cui quasi tutti i farmaci vanno incontro, principalmente a livello epatico. QUANTITA’ DI FARMACO <--> EFFETTO TERAPEUTICO <--> ELIMINAZIONE PROFARMACOEFFETTO TERAPEUTICO In alcuni casi il metabolismo trasforma un farmaco da molecola da farmacologicamente inattiva (PROFARMACO) in farmaco con EFFETTO TERAPEUTICO (es. la codeina) sostanze estranee I farmaci sono per l’organismo sostanze estranee e quindi come tali, devono essere eliminati. biotrasformazioni Nel corso dell’evoluzione si sono quindi evoluti dei processi metabolici che trasformano le molecole introdotte in metaboliti più idrosolubili e quindi più facilmente eliminabili. Queste biotrasformazioni sono effettuate da enzimi. Biotrasformazione di un farmaco

Tappe della BIOTRASFORMAZIONE dei farmaci ASSORBIMENTOMETABOLISMO ELIMINAZIONE Farmaco Coniugato Farmaco Metabolita inattivo Coniugato Metabolita con attività modificata Coniugato Farmaco FASE I FASE II LipofiloIdrofilo Le reazioni di fase I trasformano il componente iniziale in un metabolita più polare introducendo o rendendo più visibile un gruppo funzionale (OH, NH 2, SH); queste reazioni comprendono l'ossidazione, la riduzione e l'idrolisi. Molti prodotti della fase I non sono comunque eliminati rapidamente e subiscono una successiva reazione -> fase II Nella fase II un substrato endogeno (come l ’ acido glucuronico, l ’ acido solforico, l ’ acido acetico o un amminoacido) si combina con il neoformato gruppo funzionale, formando un CONIUGATO ad alta polarità. In alcuni casi le reazioni di fase II possono precedere quelle di fase I

I citocromi CYP450 sono gli enzimi maggiormente coinvolti nel metabolismo di faseI I citocromi CYP450 sono gli enzimi maggiormente coinvolti nel metabolismo di fase I La reazione più comune catalizzata dal CYP450 è una classica reazione di OSSIDAZIONE -> Trasferimento di un atomo di Ossigeno dall’ossigeno molecolare (O 2 ) ad un substrato organico (farmaco), con riduzione del secondo atomo di ossigeno ad acqua:H + O 2 +2H + +2e - OH + H 2 O CYP450 Fe 3+ CYP450 Fe 2+ I citocromi P450 mediano circa l’ 80% del metabolismo di FASE I di farmaci usati abitualmente e partecipa al metabolismo di un elevato numero di prodotti chimici xenobiotici. I citocromi CYP450 sono enzimi della classe delle MONOOSSIDASI, localizzati prevalentemente nel fegato. Il 56% dei farmaci sono metabolizzati da enzimi della FASE I.

Ciclo del CITOCROMO P450 nell ’ ossidazione dei farmaci Per la ossidazione di un farmaco, ad opera di un citocromo P450, sono coinvolte 2 proteine 2) una EMOPROTEINA chiamata CITOCROMO P450; funziona come OSSIDASI. Il nome di questo citocromo deriva dalle caratteristiche di assorbimento del gruppo EME di questa emoproteina. Nella sua forma ridotta (ferrosa -> Fe 2+ ) lega il monossido di carbonio formando un complesso che ha un max di assorbimento a 450 nm di lunghezza d ’ onda. P450 - Fe 3+ 1 R-H (FARMACO originario) RH Il citocromo P450 ossidato (Fe 3+ ) si combina con il substrato (farmaco-RH) dando luogo ad un complesso binario Un secondo elettrone è introdotto a partire da NADPH mediante la stessa flavinproteinreduttasi, ciò serve a ridurre l ’ ossigeno ed a produrre un complesso “ ossigeno attivato ” citocromo P-450-farmaco H2OH2O 4 R-OH (FARMACO ossidato) L ’ ossigeno attivato è trasferito al farmaco con formazione del prodotto ossidato Oltre a queste due proteine sono richiesti il NADPH e l ’ OSSIGENO MOLECOLARE. 1) una FLAVOPROTEINA, la NADPH-citocromo P450 reduttasi, trasportatrice di elettroni. Questo enzima contiene una molecola di Flavin mononucleotide (FMN) ed una di Flavin- adenindinucleotide (FAD). Questa proteina è anche chiamata POR: (P450 Ossido-Reduttasi) 3 e- P450-Fe 2+ O2O2 O2O2 RH NADP + NADPH Flavoproteina ridotta Flavoproteina ossidata 2 P450-Fe 2+ RH NADPH dona un primo elettrone alla REDUTTASI flavoproteica, cha a sua volta riduce il complesso farmaco-citocromo p450 e - POR

SNPs detti snips La maggior parte dei geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci presentano variazioni (POLIMORFISMI) anche di singoli nucleotidi (SNPs detti snips) nella loro sequenza e gli enzimi prodotti dalle forme varianti possono avere una funzionalità ridotta. Lo studio dei geni coinvolti nella produzione di questi enzimi può dare informazioni sulla capacità di un individuo di metabolizzare specifici farmaci. SNPs detti snips La maggior parte dei geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci presentano variazioni (POLIMORFISMI) anche di singoli nucleotidi (SNPs detti snips) nella loro sequenza e gli enzimi prodotti dalle forme varianti possono avere una funzionalità ridotta. Lo studio dei geni coinvolti nella produzione di questi enzimi può dare informazioni sulla capacità di un individuo di metabolizzare specifici farmaci. I polimorfismi dei citocromi sono coinvolti nelle ADRs

CIRCA L’80% DEI GENI DELL’UOMO PRESENTA VARIAZIONI DI SEQUENZA TRA INDIVIDUI I GENI SONO PRESENTI SOTTO FORMA DI VARIANTI ALLELICHE DIVERSE QUANDO UNA VARIAZIONE DI SEQUENZA DEL DNA E’ PRESENTE NELL’1% DELLA POPOLAZIONE -> POLIMORFISMO AL DI SOTTO DELLO 0,1% -> MUTAZIONE I POLIMORFISMI PIU’ FREQUENTI SONO GLI SNPs

Polimorfismi del singolo nucleotide (SNPs) È noto che ogni 1000 basi circa nel DNA (fatto da circa 3 miliardi di nucleotidi) ve ne è una che è DIVERSA in diversi individui. Polimorfismi del Singolo Nucleotide Ciò che cambia, la maggior parte delle volte, è un singolo nucleotide, queste variazioni individuali sono chiamate “Polimorfismi del Singolo Nucleotide” (o SNPs) Genomes A Deep Catalog of Human Genetic Variation “1000genomi”. Sono noti già alcuni milioni di SNPs e sono ora in corso dei progetti che prevedono di sequenziare singoli genomi di individui (almeno 1000) e questo progetto si chiama “1000genomi”. Come gli SNPs possono essere collegati alle reazioni individuali a farmaci I “polimorfismi” nei geni codificanti per i CITOCROMI sono la principale causa delle alterazioni nella loro funzionalità!

I citocromi P450 sono coinvolti nel metabolismo di fase I dei farmaci detossificare I citocromi sono delle MONOOSSIDASI, enzimi molto conservati dai batteri all’uomo. La funzione che hanno assunto nel corso dell’evoluzione è stata quella di “detossificare” l’organismo. In particolare le famiglie 1 e 2 sono quelle che si sono maggiormente specializzate, nel corso dell’evoluzione, nel metabolismo di fase I dei farmaci. 57 geniNel genoma umano ci sono 57 geni per i citocromi P450 e altrettanti pseudogeni. Sono suddivisi in famiglie e sottofamiglie CYP2D6, CYP2C9CYP2C19 analgesici, antiipertensivi, antiepilettici, antiallergici, antiinfiammatori, antivirali, antitumorali MOLTO POLIMORFICI! I citocromi CYP2D6, CYP2C9 e CYP2C19 metabolizzano la maggior parte dei farmaci di uso comune: analgesici, antiipertensivi, antiepilettici, antiallergici, antiinfiammatori, antivirali, antitumorali e molti altri. Questi tre enzimi sono MOLTO POLIMORFICI! Un’altra classe di enzimi con effetti importanti, se polimorfici, sono CYP1A2 CYP2D6, CYP2C9CYP2C19 analgesici, antiipertensivi, antiepilettici, antiallergici, antiinfiammatori, antivirali, antitumorali MOLTO POLIMORFICI! I citocromi CYP2D6, CYP2C9 e CYP2C19 metabolizzano la maggior parte dei farmaci di uso comune: analgesici, antiipertensivi, antiepilettici, antiallergici, antiinfiammatori, antivirali, antitumorali e molti altri. Questi tre enzimi sono MOLTO POLIMORFICI! Un’altra classe di enzimi con effetti importanti, se polimorfici, sono CYP1A2 3A4 ( 30%) poco polimorfico 1A2 (15%) 2E1 (10%) 2D6(5%) 2C8 (<5%) 2C9(20%) 2A6 (<5%) 2C19(5%) 2B6 (<5%)

Farmaci metabolizzati dai CYP450 2D6, 2C9 e 2C19 Antistaminici Desloradatina Terfenadine IdroxizinaAntiallergici Loratadina PrometazinaAntiasmatico Antidepressivi Arformoterolo Antidepressivi Amitriptilina Fluoxetina [Prozac] Imipramina Nortriptilina ParoxetinaAntiepilettico Antipsico tico Mefenitoina Antipsico tico Aloperidolo DebrisochinaAntiaritmico Lidocaina SparteinaAntidolorifici Morfina Ossicodone  bloccante BufuraroloFANS Diclofenac (Voltaren)Ipoglicemizzante FenforminaAnalgesico Codeina*CYP2D6 Antiasmatico Montelukast ZileutoneAntidepressivo Clomipramina Fluoxetina [Prozac] Imipramina Antiepilettico Antiepilettico Mefenitoina FenitoinaAntifungino Fluconazolo  -bloccante CarvediloloFANS Ibuprofene Diclofenac (Voltaren)Antiulcera Lansoprazolo PantoprazoloAntipertensivo LosartanAntivirale RitonavirAntitumorale Tamoxifene CYP2C9Antidepressivo Desipramina ImipraminaAntibiotico Amoxicillina (Augmentin) ClaritromcinaAntiepilettico Mefenitoina Fenobarbitale FenitoinaAntidolorifico MetadoneAntiepilettico Oxcarbazepina*.FANS Antiulcera Diclofenac (Voltaren) Antiulcera Ranitidina Lansoprazolo OmeprazoloAntivirale RitonavirVasodilatatore NicardipinaCYP2C19 * I farmaci segnati con l’asterisco sono PROFARMACI e vengono trasformati in molecole farmacologicamente attive dal citocromo CYP2D6CYP2D9CYP2C19 analgesici, antiipertensivi, antiepilettici, antiallergici, antiinfiammatori, antivirali, antitumorali Il CYP2D6, CYP2D9 e CYP2C19 sono coinvolti nelle trasformazioni di molti tipi di farmaci di uso comune, tra cui: analgesici, antiipertensivi, antiepilettici, antiallergici, antiinfiammatori, antivirali, antitumorali e molti altri.

Fenotipi conseguenti ai polimorfismi dei citocromi METABOLIZZATORI DEBOLI o Poor Metabolyzer (PM): sono soggetti che mancano dell’enzima o hanno un enzima che funziona poco METABOLIZZATORI DEBOLI o Poor Metabolyzer (PM): sono soggetti che mancano dell’enzima o hanno un enzima che funziona poco 1)Metabolismo del farmaco lento 2)Alti livelli plasmatici di farmaco ai dosaggi ordinari 3)Alto rischio per ADR 4)Nessuna risposta per alcuni PROFARMACI (es. codeina) METABOLIZZATORI ULTRARAPIDI o Ultrarapid Metabolyzer (UM): sono soggetti che hanno maggiori quantità di enzima e metabolizzano in modo molto rapido 1)Metabolismo troppo rapido del farmaco 2)Nessuna risposta al farmaco a dosi ordinarie -METABOLIZZATORI NORMALI (EM)-> -METABOLIZZATORI NORMALI (EM) -> hanno 2 copie funzionali del citocromo in esame! -METABOLIZZATORI INTERMEDI (IM)-> -METABOLIZZATORI INTERMEDI (IM) -> sono eterozigoti, hanno una copia del gene normale e l’altra copia che produce un enzima non funzionante!

Nortriptilina inattiva Nortriptilina Effetti sulla depressione Effetti tossici Extensive Metabolyzer (due copie funzionali del gene) CYP2D6 Poor Metabolyzer (gene scarsamente funzionale/ assente) Nortriptilina Effetti dei diversi fenotipi dovuti a CYP2D6 sulla risposta alla Nortriptilina (un antidepressivo triciclico) Ultrarapid Metabolyzer (più copie funzionali del gene) Nortriptilina CYP2D6 Nortriptilina inattiva. Nortriptilina inattiva Nortriptilina inattiva

MORFINA (ATTIVA) Codeina (INATTIVA) Effetti sul dolore Effetti tossici Extensive Metabolyzer (due copie funzionali del gene) CYP2D6 Effetti dei diversi fenotipi dovuti a CYP2D6 sulla risposta alla Codeina (un antidolorifico) Ultrarapid Metabolyzer (più copie funzionali del gene) Codeina (INATTIVA) CYP2D6 Morfina (ATTIVA) Morfina (ATTIVA) Morfina ATTIVA CYP2D6 Poor Metabolyzer (gene scarsamente funzionale/ assente) Codeina (INATTIVA) Codeina (INATTIVA) Codeina (INATTIVA)