Cellula Staminale Ematopoietica (HSCs) Cellula Staminale Mesenchimale MIDOLLO ADULTO Cellula Staminale Ematopoietica (HSCs) Cellula Staminale Mesenchimale o Stromale (MSCs)

IL MIDOLLO OSSEO

Ematopoiesi Il Sistema Ematopoietico rappresenta un continuum di cellule che progressivamente manifestano differenti caratteristiche biologiche: … da cellula staminale a … vari tipi cellulari differenziati Variazioni biologiche rilevate nei vari compartimenti “maturanti” non riflettono quelle che si attuano nel compartimento staminale I vari compartimenti ematopoietici sono controllati da differenti fattori che variano indipendentemente l’uno dall’altro

Ininterrotta formazione di elementi giovani Ematopoiesi Ininterrotta formazione di elementi giovani del sangue a partire da cellule staminali: origine a tutte le linee emopoietiche

Microambiente ematopoietico Fattori fisici: tempo, spazio, superficie e viscosità del mezzo Fattori nutritivi: aa, zuccheri, lipidi, elettroliti, oligominerali, vitamine Microambiente biologico: cellule circostanti Fattori specifici: inibitori, stimolatori, anticorpi, etc.

HSC Differentation Citochine Il processo è regolato da un intricato numero di fattori di crescita e citochine Citochine Prodotte attraverso meccanismi autocrini e paracrini da cellule non ematopoietiche quali stromali ed endoteliali

Citochine -L’interleuchina 3 (IL-3) ed il granulocyte/macrophage colony stimulating factor (GM-CSF): inducono la proliferazione cellulare dei progenitori iniziali

Citochine -L’eritropoietina, l’interleuchina 5 (IL-5) ed il macrophage colony stimulating factor (M-CSF): agiscono essenzialmente sulla proliferazione e\o differenziazione dei progenitori più avanzati e sull’attivazione delle cellule terminali mature. -Flt-3 ligand e kit ligand proteggono le cellule dall’apoptosi

Chemochine Inibizione della crescita dei progenitori Regolazione della migrazione dei progenitori ematopoietici Mediare lo sviluppo delle cellule T nel timo SDF-1 (che lega il recettore CXCR4) media il processo di homing di HSCs e progenitori nel midollo dopo il trapianto

Altri regolatori…… Componenti della ECM che rappresentano uno scaffold per la localizzazione delle staminali Cellule ematopoietiche e non ematopoietiche Nutrienti, vitamine Molecole di adesione (integrine, selectine e mucine) che mediano le interazioni tra HSCs e progenitori con i componenti della ECM

HSCs Plasticità HSCs may have sufficient plasticity as to be able to generate non hematopoietic cells including hepatocytes, muscle cells, epidermal cells, islet cells, neurons, myocardium, and other lineages under the right environmental conditions

HSCs Assay

Short-term in vitro Assays I prototipi dei saggi funzionali a breve termine sono rappresentati dai saggi a colonie La sospensione cellulare viene quindi piastrata in terreno semisolido rappresentato da metilcellulosa oppure da agar.

Composizione Grandezza Colore la progenie che deriva da una singola cellula costituisce una colonia che differisce dalle altre per: Composizione Grandezza Colore Ogni colonia rappresenta un continuum di progenitori “lineage committed”

Nell’ambito di un data linea cellulare, i progenitori con differenti livelli di maturità, possono essere riconosciuti in base a tre diversi parametri: Sensibilità di risposta ai fattori di crescita Tempo necessario per generare una progenie di cellule differenziate La grandezza e la particolare morfologia delle colonie

●Cellule progenitrici della serie eritroide (BFU-E e CFU-E) progenitori iniziali e più differenziati rispettivamente ●Cellule progenitrici della serie granulo-macrofagica (CFU-GM, CFU-G e CFU-M) ●Cellule progenitrici della serie megacariocitaria (BFU-MK, CFU-MK)

Saggi Funzionali PROLIFERAZIONE CELLULARE: misurata attraverso il numero di cellule prodotte POTENZIALE DIFFERENZIATIVO: stimato attraverso il numero di linee cellulari rappresentate nella progenie prodotta

Limite dei Saggi a Colonie a Breve Termine Non risultano adeguati per identificare progenitori più immaturi Inadeguatezza dei mezzi semisolidi utilizzati L’efficacia di un mezzo semisolido non supera le tre settimane

Una Stem Cell molto immatura necessita di un periodo superiore a 3 - 5 settimane affinchè possa garantire una progenie di cellule differenziate.

Long-Term Culture Presenza di un feeder layer costituito da cellule che da un lato fungono da substrato e dall’altro provvedono a secernere fattori di crescita nel tentativo di ricostituire il microambiente ematopoietico

Feeder Layer Cellule normali aderenti midollari allogeniche, espanse per 4 settimane e successivamente irradiate Linee cellulari continue murine derivate dallo stroma midollare

Linee Cellulari Continue Murine Le più note sono MS5, S17, AFT024 ed M210B4 Sono facilmente gestibili rispetto alle cellule stromali fresche allogeniche L’ottenimento del loro numero è ILLIMITATO Supportano egualmente bene sia la differenziazione mieloide che quella linfoide a partire da progenitori lineage-committed

UNITA’ EMATONE STROMA + CELLULE EMATOPOIETICHE CELLULE NON-EMATOPOIETICHE (Cellule Mesenchimali) Struttura funzionale, rappresentata da un ago aspirato midollare, indispensabile per la comprensione dei meccanismi biologici che regolano in vivo la Cavità della Cellula Staminale ovvero Stem Cell Niche.

STROMA Le cellule stromali nel loro insieme sono costituite da adipociti, cellule endoteliali, macrofagi e fibroblasti.

Molecole di Adesione, e Fattori di crescita P-selectin IL6 G-CSF GM-CSF M-CSF SCF Flk-2 VEGF2R E-selectin CD105 endoglin VLA-4 VCAM-1 ICAM-1 Molecole di Adesione, e Fattori di crescita

GM-CSF G-CSF M-CSF IL6 IL1 TNF-a TGF-b Macrofago

Concetto di Nicchia Microambiente stabile per la cellula staminale E’costituita da cellule e componente extracellulare che può ospitare una o più cellule staminali e controllarne l’autorinnovamento nonchè la produzione di progenie La matrice extracellulare insieme alle molecole di adesione definiscono i confini spaziali della nicchia e modulano l’espressione di molecole di adesione nonchè quelle deputate al signalling

Concetto di Nicchia La scelta di una cellula staminale se rimanere nel suo stato di quiescenza o dividersi è guidata dal microambiente. -Angiopoietin-1 (Ang-1): il fattore secreto dagli osteoblasti e il suo recettore (Tie2) hanno grande importanza per il contatto delle HSC alle cellule della nicchia mantenendole in uno stato di quiescenza -p21: controlla il numero delle cellule staminali, mantenendo la popolazione staminale in uno stato di quiescenza -p27: controlla la proliferazione dei precursori ematopoietici e il loro pool all’interno dell’organismo -Growth factor independent 1 (Gfi-1): regola la proliferazione delle cellule T

Figure 1 Niche structure Figure 1 Niche structure. Niche cells (green) underlying a basement membrane signal to stem cells (red) to block differentiation and regulate division. When a lineage mechanism prevails (lower mitotic cell), the stem cell divides such that one daughter retains its connections to the niche, while the other (yellow) becomes untethered and begins to differentiate. When a population mechanism prevails (upper mitotic cell), stem cell division may be either symmetric (shown) or asymmetric (not shown), as determined by local factors. ECM, extracellular matrix.

Un incremento dell’attività osteoblastica attraverso la stimolazione del recettore dell’ormone paratiroideo o l’inattivazione del recettore BMP-1a, causa un incremento del numero delle HSC. Al contrario, l’attivazione degli osteoclasti mediante RANKL o stress causa una mobilizzazione delle HSC nel circolo

Colture a Lungo Termine LTC-IC CAFC Extended LTC-IC (ELTC-IC)

LTC-IC La “Long-Term Culture Initiating Cell” identifica un tipo cellulare che è in grado, quando coltivata su un supporto costituito dallo stroma, di dare origine a cellule figlie identificabili mediante l’applicazione di saggi a colonie. La LTC-IC rappresenta, quindi, la primitiva cellula ematopoietica che è in grado di sostenere la produzione di tutte le linee cellulari ematopoietiche per l’intera vita di un individuo.

CAFC La “cobblestone area-forming cell” identifica un tipo cellulare che si integra nello strato aderente stromale. La colonia cellulare è costituita, pertanto, da cellule appiattite, otticamente dense e strettamente associate alle cellule aderenti.

Cobblestone Area. La CA è composta da cellule scure, angolari, associate ad una cellula adiposa (F). Si osservano cellule in sospensione (S), brillanti, ed un macrofago (M).

Extended LTC-IC (ELTC-IC) L’Extended LTC-IC probabilmente identifica un tipo cellulare la cui longevità è strettamente associata a quella attesa per una vera e propria cellula staminale. ELTC-IC si ottiene estendendo il saggio LTC-IC ad un periodo superiore a 12 settimane.

Immunofenotipo delle h-HSCs CD34: HSCs e precursori ematopoietici CD133: HSCs e precursori ematopoietici CD45, CD43, CD38, CD59, CD90, Flt3,….

Cellula Staminale Mesenchimale Mentre le Cellule Staminali Ematopoietiche rappresentano a tutt’oggi le cellule staminali meglio caratterizzate, la Cellula Staminale Stromale Midollare rimane ancora poco caratterizzata sia in termini morfologici che molecolari. La sua corretta localizzazione tissutale e la sua frequenza in ambito midollare è ancora poco nota. Infatti la maggior parte delle conoscenze attuali deriva dall’osservazione in vitro della sua progenie.

FONTI DI CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI Midollo osseo Tessuto adiposo Sangue cordonale placenta Sangue periferico

IMMUNOFENOTIPO DELLE MSC ● Non esistono antigeni specifici per MSC CD34 L’espressione di CD34 è dibattuta Non è espresso sulle hMSC espanse in coltura ma è espresso sulle cellule del midollo osseo fresco. Probabilmente l’espressione è correlata allo stadio proliferativo della cellula.

La caratterizzazione fenotipica delle MSC umane si basa sulla loro positività per alcuni antigeni non esclusivi delle MSC e sulla negatività per antigeni tipicamente espressi dalle cellule di derivazione emopoietica.

IMMUNOFENOTIPO DELLE MSC CD locus function CD 45 Leucocyte common antigen - Glicoforina A CD14 Recettore del lipopolisaccaride CD50 ICAM3 CD34 sialomucina CD44 Recettore acido ialuronico + Sca I stem cell antigen CD29 VLA-β chain CD49 α1-6 VLA –α chain CD106 VCAM1 CD117 cKit, stem cell factor receptor CD90 Thy1 CD71 Recettore transferrina CD271 Recettore NGF (nerve growth factor) CD140a Recettore PDGF (Platelet derived growth factor) Recettore IGF1 (insulin like growth factor 1) Recettore EGF (epidermidal growth factor) CD105 Endoglina

Nicchia delle MSCs. Mesenchymal stem cells (MSCs) are shown in their putative perivascular niche (BV, blood vessel), interacting with (1) various other differentiated cells (DC1, DC2, etc.) by means of cell-adhesion molecules, such as cadherins, (2) extracellular matrix (ECM) deposited by the niche cells mediated by integrin receptors, and (3) signaling molecules, which may include autocrine, paracrine, and endocrine factors. Another variable is O2 tension, with hypoxia associated with MSCs in the bone marrow niche.

Procedura di isolamento di cellule staminali da midollo osseo ●Diluizione del midollo osseo 1:5 in Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) + 2% fetal bovine serum (FBS) e frazionamento secondo un gradiente di densità (Ficoll-Hypaque) per 30 minuti a 240 x g. ●Raccolta dello strato di cellule mononucleate compreso tra lo strato acquoso e il Ficoll. Lavaggio (2X) in PBS e 2% FBS a 160 x g. ●Il pellet è risospeso in 5-10 ml in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), supplementato con il 20% FBS, 1% l-glutammina, senza aggiunta di antibiotici ed antimicotici. ●Conta cellulare e semina ad un volume di 1 x 107 cells/cm2 in 6 well dishes. ●Le cellule saranno cresciute a 37°C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2.

Procedura di isolamento di cellule staminali da midollo osseo ●Cambio di mezzo di coltura approssimativamente dopo una settimana dalla semina delle cellule; le hMSC aderiranno alla plastica di coltura cellulare entro i primi 5-7 giorni. ●Le cellule saranno poi espanse mediante l’allontanamento delle cellule non aderenti nel corso dei cambi di mezzo di coltura. Sarà possibile centrifugare il mezzo allontanato e ripiastrarlo in un nuovo disco di coltura. ●E’ importante mantenere le cellule ad una giusta confluenza per impedire che possano differenziare. Le colture confluenti saranno staccate dalla piastra mediante il trattamento tripsina-EDTA. ●Le cellule saranno congelate in una soluzione di congelamento costituita da 10% DMSO e 90% siero.

Dopo circa 5-7 settimane si ottiene una popolazione omogenea di cellule aderenti, con aspetto simil-fibroblastico, la quale continua a proliferare senza differenziare spontaneamente fino a 40 generazioni.

Pass.2 Pass.2 Pass.12 Pass.12

● Nel corso della coltura le MSC isolate ed espanse in vitro non modificano il proprio fenotipo di membrana né il proprio potenziale differenziativo multilineare, permanendo in uno stato indifferenziato. ● In presenza però di opportuni terreni condizionati sono in grado di differenziare nelle varie linee di origine mesodermica, come quella adipogenica, osteogenica, condrogenica e miogenica, proprietà che attesta la natura staminale di tali cellule.

La differenziazione adipocitaria viene indotta con un terreno contenente desametasone (1 mM), insulina e 3-isobutil-1-metilxantina, fattori che attivano le vie metaboliche della sintesi lipidica.

La differenziazione osteoblastica viene indotta con un terreno contenente desametasone in quantità minori rispetto a quello usato nella differenziazione adipocitaria (0.1 mM), acido ascorbico e β-glicerofosfato. Le cellule assumono una forma poligonale e depositano nello spazio extra-cellulare una matrice mineralizzata rifrangente la luce al microscopio ottico, che si colora intensamente mediante colorazioni tipo von Kossa o reazioni alla fosfatasi alcalina.

La differenziazione condrocitaria viene ottenuta con un terreno simile a quello osteogenico, contenente desametasone ed acido ascorbico, ma con l’aggiunta di Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1), prolina ed altri fattori. Le cellule assumono una morfologia globosa e si dispongono in filiere similepiteliali. La matrice cartilaginea viene colorata intensamente mediante blu di toluidina e le cellule diventano positive, in immunoistochimica, per il collagene di tipo II.

La differenziazione miogenica viene indotta incubando le cellule con amphotericina B o con 5-fluorocitidina: si osserva un progressivo allungamento delle cellule, la formazione di miotubuli e la comparsa di attività contrattile spontanea o indotta da acetilcolina. L’avvenuta differenziazione miocellulare viene dimostrata in immunoistochimica attraverso l’espressione di miogenina, myo D (fattore di trascrizione coinvolto nella differenziazione delle cellule mesenchimali in senso mioblastico) o miosina).

Il pathway osteogenico è favorito: -Commitment intrinseco -Le condizioni di coltura in vitro rappresentano un “microenvironment” che favorisce l’osteogenesi

DIFFERENZIAMENTO Non si differenziano spontaneamente in coltura, dove possono subire circa 40 duplicazioni, mantenendo un cariotipo normale e una normale attività telomerasica. Dopo 1-3 settimane in coltura in condizioni specifiche esse possono differenziare. DIFFERENZIAMENTO ADIPOGENICO: Cellule ricche di vacuoli di lipidi (colorazione istochimica Red Oil) DIFFERENZIAMENTO CONDROGENICO: (colorazione immunoistochimica con Ab anti-collagene II) DIFFERENZIAMENTO OSTEOGENICO: (colorazione istochimica fosfatasi alcalina)

DIFFERENZIAMENTO OSTEOGENICO Colorazione istochimica fosfatasi alcalina 3 cloni di hMSC Il differenziamento in osteoblasti non è sorprendente; il midollo osseo è contenuto all’interno del canale diafisario delle ossa lunghe dove la struttura dell’osso è estremamente simile a quella dell’osso spugnoso che si rimodella continuamente, perciò non sorprende che campioni di midollo prelevati dall’osso possano contenere precursori di osteoblasti. 2 linee cellulari fibroblastiche

DIFFERENZIAMENTO CONDROGENICO Colorazione immunoistochimica con Ab anti-collagene II 3 cloni di hMSC La capacità delle MSC di differenziare in condrociti può essere associata al processo di riparo di una frattura, poiché piccole quantità di cartilagine appaiono nei siti di frattura prima che il callo venga sostituito da osso. 2 linee cellulari fibroblastiche

DIFFERENZIAMENTO ADIPOGENICO Colorazione istochimica Red Oil 3 cloni di hMSC La capacità delle MSC di differenziare in adipociti può essere associata all’osservazione che il midollo viene in parte sostituito con l’adipe durante la vecchiaia. 2 linee cellulari fibroblastiche