Alterazione dell’espressione delle isoforme del gene OLR1 in donne con abortività spontanea ricorrente (ASR) come possibile biomarker diagnostico predittivo Rizzacasa B. 1, Pietropolli A. 2, Bruno V. 2, Capogna M.V. 2, Massoud R. 3, Ticconi C. 2, Borgiani P. 1, Piccione E. 2, Cortese C. 3, Novelli G. 1, Amati F Dipartimento di Biomedicina e Prevenzione, Sezione di Genetica Medica, Universita` di Roma Tor Vergata, Roma, Italia; 2. Dipartimento di Biomedicina e Prevenzione, Sezione di Ginecologia e Ostetricia, Universita` di Roma Tor Vergata, Roma, Italia ; 3. Dipartimento di Medicina Sperimentale e Chirurgia, Universita` di Roma Tor Vergata, Roma, Italia L’aborto spontaneo ricorrente (ASR) interessa il 2% della popolazione femminile e rappresenta la più comune complicanza ostetrica. Recenti evidenze indicano che un elevato stress ossidativo, sia a livello sistemico che placentare, gioca un ruolo chiave in questa patologia causando un’ossidazione lipidica incontrollata e una riduzione del turnover delle lipoproteine ossidate a bassa densità (oxLDLs) (Figura 1). Data l’assenza di dati riguardo la correlazione tra ASR ed espressione del gene OLR1, è stato condotto uno studio pilota su 63 donne, in gravidanza e non in gravidanza, sia con una storia di abortività spontanea ricorrente che controlli con gravidanze fisiologiche, al fine di valutare il pattern di espressione delle isoforme OLR1 e Loxin come possibile biomarker diagnostico predittivo per questa patologia. MATERIALI E METODI OBIETTIVO INTRODUZIONE SOGGETTI ARRUOLATI NELLO STUDIO: Questo studio pilota ha coinvolto 63 donne in età riproduttiva divise in quattro gruppi: - 18 donne in gravidanza con storia di aborto ricorrente idiopatico (p-uRM); - 23 donne non in gravidanza con storia di aborto ricorrente idiopatico (uRM); - 12 donne gestanti con gravidanza fisiologica (p-CTR); - 10 donne non gestanti con precedenti gravidanze fisiologiche a termine (CTR). Tutte le donne incluse in questo studio sono state seguite come pazienti ambulatoriali nell’Unità Operativa di Ginecologia e Ostetricia del Policlinico Universitario di Tor Vergata, Roma. Tutte le pazienti con poliabortività sono state sottoposte ad un iter diagnostico standardizzato. L’esclusione di tutte le cause note di abortività ha permesso l’arruolamento dei soggetti nel nostro studio. I gruppi di controllo includono donne con almeno due gravidanze fisiologiche a termine e senza storia di aborti. Queste donne sono state seguite in accordo con i protocolli standard per la normale sorveglianza ginecologica o ostetrica. Le donne gestanti (sia con uRM che controlli) sono state arruolate nello studio entro la 12 settimana di gestazione. ISOLAMENTO DI PBMCs E SIERO: PMBCs e siero sono stati isolati da ogni campione a partire da sangue intero (10mL) usando il Ficoll® Paque Plus (GE Healthcare) in accordo con quanto indicato dal protocollo fornito dal kit. I PBMCs così isolati, risospesi in 1mL Trizol® (Ambion), e il siero sono stati conservati a -80°C fino alle successive analisi. ANALISI DELL’ESPRESSIONE DI OLR1 E LOXIN: Il cDNA derivato dai PBMCs è stato analizzato attraverso saggi di Real Time PCR (SYBR Green Assay, Applied Biosystems) per indagare il livello dell’espressione di ogni isoforma del gene OLR1 usando coppie di primers specifici disegnati con il software Primer Blast (OLR1: F 5’- GCACAGCTGATCTGGACTTCAT-3’, R 5’-CCCCATCCAGAATGGAAAACT-3’; Loxina: F 5’-AAAAGAGCCAAGAGAAGTGCTTGT- 3’, R 5’-TCTAAATCAGATCAGCTGTGC-3’). I geni RPL37A e β-actin sono stati utilizzati come normalizzatori. Ogni analisi di qRT-PCR è stata effettuata in triplicato per almeno due volte per ogni campione. ANALISI BIOCHIMICHE SUL SIERO: La valutazione di parametri biochimici di routine è stata effettuata utilizzando il Siemens Dimension Vista® 1500 System (Inc., South San Francisco, CA). La valutazione quantitativa della concentrazione sierica delle lipoproteine ossidate a bassa densità (oxLDLs) è stata condotta usando un saggio immunologico (Mercodia AB, Uppsala, Sweden). TEST STATISTICI: Dato il numero dei soggetti coinvolti nello studio e la distribuzione statistica dei valori considerati, tutti i dati sono stati analizzati attraverso i test statistici Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Un p value ≤0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Figura 3. Espressione delle isoforme del gene OLR1. A) Gruppo di controllo non in gravidanza (CTR) vs gruppo di controllo in gravidanza (p-CTR). B) Donne con abortività ricorrente idiopatica (uRM) vs donne con abortività ricorrente idiopatica in gravidanza (p-uRM). C) Gruppo di controllo non in gravidanza (CTR) vs donne con abortività ricorrente idiopatica (uRM). D) Gruppo di controllo in gravidanza (p-CTR) vs donne con abortività ricorrente idiopatica in gravidanza (p-uRM). *=p≤0,05; **=p≤0,005 RISULTATI Figura 4. A) Rapporto dell’espressione OLR1/Loxin. B) Concentrazione sierica delle ox-LDL. *p=≤0,05 L’analisi del livello di espressione delle isoforme del gene OLR1 ha permesso di osservare che, nei gruppi di controllo, l’espressione di OLR1 resta invariata, mentre l’espressione della Loxina risulta diminuita di circa 2/3 durante la gravidanza (p-CTR vs CTR) (**p≤0,005) (Figura 3A). In donne con storia clinica di ASR, invece, i livelli di espressione di OLR1 risultano significativamente più elevati in donne gravide (p-uRM) rispetto a donne non gravide (uRM) (*p≤0,05); in questo caso, non è stata osservata nessuna variazione di espressione della Loxina (Figura 3B). Dal confronto dei livelli di espressione delle isoforme OLR1 e Loxina in donne non in gravidanza con storia di ASR (uRM) e il gruppo di controllo non in gravidanza (CTR), è emersa la presenza di una significativa riduzione dei livelli di espressione di entrambe le isoforme in donne non in gravidanza con ASR [rispettivamente OLR1: 0,00018 vs 0,00043, p≤0,005; Loxina: 0,00018 vs0,00060, **p≤0,005] (Figura 3C). Infine, confrontando i livelli di espressione di OLR1 e Loxina durante la gravidanza, non si osserva nessuna variazione di espressione in donne gravide con ASR (p-uRM) rispetto al gruppo di controllo (p-CTR) (Figura 3D). CONCLUSIONI Questo è il primo studio che mostra alterazioni nell’espressione delle isoforme OLR1 e Loxina in donne con storia di aborto spontaneo ricorrente. Tali alterazioni, supportate dalla presenza di una concentrazione di oxLDLs sieriche elevata nelle donne in gravidanza con ASR, suggeriscono che l’instaurarsi di una condizione di stress ossidativo incontrollato, durante le prime fasi della gravidanza, possa essere collegata con lo sviluppo di questa complicanza ostetrica. Inoltre, la significativa riduzione di entrambe le isoforme del gene OLR1, nel gruppo di donne non in gravidanza con ASR rispetto al gruppo di controllo, potrebbe avere un ruolo pre-concezionale negativo, per esempio nei processi di preparazione dell’endometrio e/o del sistema immunitario alla gravidanza. Questo particolare pattern di espressione di OLR1 e Loxin, in donne con storia di abortività spontanea ricorrente idiopatica, potrebbe essere proposto come biomarker diagnostico predittivo di rischio di ASR. La valutazione del rapporto di espressione OLR1/Loxina ha permesso di osservare un incremento, seppur non statisticamente significativo, di questo rapporto durate la gravidanza (p-CTR e p-uRM) rispetto a quanto osservato per i due gruppi costituiti da donne non gravide (CTR e uRM). In particolare, è interessante notare che il gruppo costituito da donne gravide con aborto spontaneo ricorrente (p-uRM) mostra un rapporto OLR1/Loxina più elevato rispetto al gruppo costituito da donne gravide con gravidanza fisiologica (p-CTR) (Figura 4A). Infine, la valutazione della concentrazione sierica delle oxLDLs, principali ligandi del recettore LOX-1, ha permesso di osservare che i livelli sierici delle oxLDLs sono significativamente più elevati nelle donne gravide con storia di ASR (p-uRM) rispetto al gruppo di controllo (*p≤0,05) (Figura 4B). Figura 2. Isoforme del gene OLR1. Il principale recettore endoteliale per le oxLDLs, LOX-1, è altamente espresso nella placenta ed è fisiologicamente coinvolto nei processi d’invasione del trofoblasto nelle prime fasi della gravidanza. Inoltre, dati recenti dimostrano il suo coinvolgimento in alcune patologie ostetriche come la preeclampsia. Il recettore LOX-1 è codificato dal gene OLR1 che è soggetto a eventi di splicing alternativo generanti due isoforme, OLR1D4 e Loxina. Loxina codifica per una proteina tronca, la LOXINA, incapace di legare e internalizzare le oxLDLs (Figura 2). Figura 1. Ruolo dello stress ossidativo nell’ASR (Sajal Gupta et al, 2007).