Fermentazione continua FERMENTAZIONE BATCH Sistema chiuso F FERMENTAZIONE CONTINUA F Sistema aperto

Fermentazione continua Il rapporto tra portata F e volume residente V è chiamato velocità di diluizione D Il reciproco di D, cioè V/F, essendo un volume su una portata, è un tempo e viene denominato tempo medio di residenza R

Fermentazione continua La fermentazione in continuo è utilizzata per la prima volta nel diciannovesimo secolo in un processo per la conversione delle birre ed i vini ad aceto. La prima analisi dettagliata del sistema continuo è stata intrapresa da Jaques Monod. Da allora, sono stati compiuti sforzi considerevoli nell'analisi nell'ottimizzazione e nella progettazione di processi fermentativi che operano in continuo. Oggi, le colture continue trovano applicazione nella produzione di proteine ricombinanti prodotte in cellule animali, nell'industria di trattamento dei reflui inquinanti, anche se piuttosto limitata. I sistemi continui presentano molti vantaggi rispetto ai reattori batch, ma purtroppo anche alcuni svantaggi.

Il chemostato è il più diffuso tipo di fermentatore in continuo Si può allestire una fermentazione in continuo controllando diversi parametri In base al parametro controllato (reso costante) le fermentazioni in continuo sono così classificate: Tipo Controllo X determinato da µ determinato da Chemostato metabolico Si Turbidostato densità ottica Set point µmax pH-auxostato pH Rapporto di pH tra µmax mezzo in entrata e mezzo nel reattore Nutristato Concentrazione Si e set point Set point e Ks substrato Il chemostato è il più diffuso tipo di fermentatore in continuo

Chemostato Nella fermentazione continua in chemostato è possibile mantenere costante e per un tempo indefinito, la velocità di sviluppo m in un punto qualunque della curva risultante dal rapporto tra m ed S. Ciò si può ottenere con l'introduzione nel reattore di substrato sterile (feed) a portata costante, cui corrisponde l'uscita in modo continuo di un effluente contenente cellule e prodotto. La velocità di crescita può essere modificata semplicemente modificando il flusso del substrato in ingresso. F’ F In assenza di perdite il volume residente è costante

All’equilibrio: Chemostato Il processo incomincia con una fase batch quindi: si parte con l’alimentazione si osserva una fase di transizione tra il precedente sistema chiuso ed il successivo aperto quindi si raggiunge una condizione di equilibrio che riguarderà tutte le componenti del sistema All’equilibrio: l'effluente sarà composto dal substrato , di concentrazione inferiore rispetto a quello influente S0; da una biomassa microbica con concentrazione ed eventualmente da un prodotto da questa sintetizzato Esaminiamo quindi la cinetica dei tre parametri coinvolti nel processo continuo, X, S e P

DESCRIZIONE QUANTITATIVA DEL PROCESSO FERMENTATIVO Definire espressioni che descrivono come la concentrazione dei componenti (Y variabili di stato) X [g L-1] Peso secco della biomassa N [nL-1] Numero di Cellule S [g L-1] Substrato P [g L-1] Prodotto Variano con le condizioni del processo Variano nel tempo: cinetica del processo Descrivere la cinetica della crescita microbica Descrivere la cinetica della formazione del prodotto Descrivere la cinetica del consumo del substrato

La cinetica della crescita microbica in continuo Velocità di accumulo o di rarefazione della biomassa F=F’ X0 è la concentrazione di biomassa nel substrato influente se viene introdotto solo substrato sterile sarà X0=0. X è la concentrazione della biomassa nel volume residente V dal quale fuoriesce con portata FX; µ ed a sono le note velocità specifiche di sviluppo e di morte. Se X0=0 e quindi FX0/V=0. Inoltre in fase log µ>>a per cui -aX può essere trascurato

La cinetica della crescita microbica in continuo Anche in continuo è possibile che il substrato, se immesso nel reattore con portata bassa, tenda a raggiungere una concentrazione limitante. Tuttavia la sua continua immissione nel reattore ne assicura una certa concentrazione, legata alla portata F, che può determinare il raggiungimento di un equilibrio tra le cellule di nuova formazione e quelle che lasciano il reattore. steady-state D è il rapporto tra la portata (V/t) e il volume residente V è chiamato velocità di diluizione (h-1)

CINETICA DI SVILUPPO DELLA BIOMASSA X IN CONTINUO I^ Caso: si tende a raggiungere lo steady-state inizio processo continuo processo batch S0, F S, F, X steady-state

steady-state Se la velocità di rimozione della biomassa supera quella di formazione DX > µX D > µ allora La biomassa diminuirà La concentrazione di substrato aumenterà La velocità specifica di crescita dell’organismo aumenterà Il sistema raggiungerà un nuovo equilibrio ¯ X®­S ® ­µ ® nuovo stato di equilibrio ® µ = D

La cinetica della crescita microbica in continuo Questo significa semplicemente che possiamo regolare la velocità di crescita dell’organismo! steady-state Allo scopo di aumentare la produttività del processo si può pensare di incrementare la velocità di sviluppo m mediante l’incremento di D L’aumento di D, pur comportando un corrispondente aumento di m, ha un limite massimo, che viene indicato come mm, e che dipende dalla composizione di S0e ovviamente dalle capacità metaboliche dell’organismo. Se si incrementa D oltre un valore massimo Dm=mm, corrispondente alla massima velocità di sviluppo della biomassa alimentata con il substrato S0, il sistema diventa instabile poiché si perde la condizione di steady-state. Infatti poiché all'aumento di D non può più corrispondere un aumento di m, è sufficiente che si oltrepassi la soglia critica di portata Dcrit>Dm=mm, perché si verifichi il wash-out. D critica è il valore minimo di D a cui si ha il wash-out

CINETICA DI SVILUPPO DELLA BIOMASSA X IN CONTINUO 2^ caso: si perde lo steady-state ed inizia il wash-out steady-state D ≤ m S0, F S, F, X D>m = F V

Wash out Se la velocità di rimozione della biomassa supera quella di formazione DX > µmX D > µm allora La biomassa diminuirà La concentrazione di substrato aumenterà La velocità specifica di crescita dell’organismo non può aumentare ! ® ¯ X®­S ® µ =µm, µ < D® WASH OUT

DESCRIZIONE QUANTITATIVA DEL PROCESSO FERMENTATIVO Definire espressioni che descrivono come la concentrazione dei componenti (Y variabili di stato) X [g L-1] Peso secco della biomassa N [nL-1] Numero di Cellule S [g L-1] Substrato P [g L-1] Prodotto Variano con le condizioni del processo Variano nel tempo: cinetica del processo Descrivere la cinetica della crescita microbica Descrivere la cinetica della formazione del prodotto Descrivere la cinetica del consumo del substrato

Cinetica di consumo del substrato in continuo Assumendo: Che in fase logaritmica venga utilizzata una quantità di substrato di gran lunga maggiore per lo sviluppo rispetto a quella di mantenimento, il termine mX può essere trascurato Che non venga sintetizzato alcun prodotto, diverso dalla biomassa, il relativo termine può essere trascurato la velocità istantanea con cui aumenta o diminuisce la concentrazione substrato è legata all'equilibrio tra la portata del substrato influente e la velocità di consumo per la sintesi di X.

Cinetica di consumo del substrato in continuo steady-state in un reattore continuo in steady-state, come avviene in batch, la concentrazione di substrato nel chemostato è proporzionale alla concentrazione della biomassa Contrariamente a quanto si verifica in batch, nel processo continuo la concentrazione della biomassa X non è legata alla sua velocità di sviluppo  Equazione della biomassa allo stato stazionario

Cinetica di consumo del substrato in continuo Relazione tra velocità di diluizione, concentrazione del substrato e della biomassa allo stato stazionario dall’equazione di Monod VALIDA NEL CHEMOSTATO perché si ha limitazione della crescita rispetto al substrato steady-state Poiché abbiamo visto che La concentrazione di biomassa all’equilibrio è determinata da due variabili operazionali: D e S0

Cinetica di consumo del substrato in continuo Relazione tra velocità di diluizione, concentrazione del substrato e della biomassa allo stato stazionario La concentrazione di biomassa all’equilibrio è determinata da due variabili operazionali: D e S0 Se S0 aumenta, X aumenta ma S rimane identica. Se D aumenta ovviamente aumenta anche m e il valore di S al nuovo stato stazionario deve aumentare per supportare un valore di m più elevato quindi meno substrato sarà convertito in biomassa determinando un valore di X minore nel nuovo stato di equilibrio

Cinetica di consumo del substrato in continuo Relazione tra velocità di diluizione e concentrazione del substrato e della biomassa allo stato stazionario X Valori di Ks bassi Valori di Ks alti S S X

Dcrit dipende da Ks mmax e da S0 Wash out soglia critica di portata Dcrit>Dm=mmax Quando D è uguale a Dcrit la biomassa nel chemostato tende a zero ( wash out ) Dcrit dipende da Ks mmax e da S0

In continuo allo stato stazionario La velocità specifica è: La concentrazione di substrato è: La concentrazione della biomassa è: In una coltura continua è possibile controllare in maniera indipendenti i due parametri fondamentali di un processo fermentativo: la velocità di sviluppo della biomassa m (agendo sulla portata del substrato S0 mantenuto a concentrazione costante) e la sua concentrazione X (agendo sulla concentrazione del substrato S0 mantenuto a portata costante) mentre nel batch m e X sono interdipendenti.

DESCRIZIONE QUANTITATIVA DEL PROCESSO FERMENTATIVO Definire espressioni che descrivono come la concentrazione dei componenti (Y variabili di stato) X [g L-1] Peso secco della biomassa N [nL-1] Numero di Cellule S [g L-1] Substrato P [g L-1] Prodotto Variano con le condizioni del processo Variano nel tempo: cinetica del processo Descrivere la cinetica della crescita microbica Descrivere la cinetica della formazione del prodotto Descrivere la cinetica del consumo del substrato

Cinetica di formazione del prodotto in continuo -FP/V è la quota di prodotto allontanata con l'effluente, e che può essere indicata anche come –DP; dal momento -kP è la quota distrutta durante il processo può essere trascurata si ha steady-state La concentrazione di un prodotto P nell'effluente di un reattore in steady-state è direttamente proporzionale alla sua velocità di sintesi ed inversamente alla velocità di diluizione. relazione è valida solo quando P è strettamente associato alla sintesi della biomassa

Cinetica di formazione del prodotto in continuo steady-state poichè Se la relazione tra la velocità specifica di crescita e la concentrazione del substrato è data dal modello di Monod relazione è valida solo quando P è strettamente associato alla sintesi della biomassa

Produttività in continuo Produttività in biomassa La produttività volumetrica in biomassa in continuo può essere descritta come la biomassa in uscita dal fermentatore per unità di tempo tiii tempo necessario a raggiungere la steady state (preparazione fermentatore fase batch ecc..) T è il tempo di durata del processo in continuo In batch la produttività è massima solo alla fine del processo, in continuo, raggiunto l’equilibrio con una D opportuna, durante tutta la fermentazione. Inoltre il valore di tiii rispetto a T è trascurabile non è così in batch dove i tempi di preparazione alla fermentazione non sono trascurabili rispetto all’intera durata del processo D Dcrit Se in condizioni di steady-state si mantiene, D inferiore a Dm, il sistema è tanto stabile da poter compensare momentanee variazioni di portata del substrato purché queste non superino il punto di wash-out. E’ questa la situazione che si cerca di mantenere in un processo continuo anche se ciò comporta una produttività inferiore alla massima teorica che si verifica solo quando Dm=mm.

Produttività in continuo Prodotto La produttività volumetrica in prodotto in continuo può essere descritta come il prodotto in uscita dal fermentatore per unità di tempo relazione è valida solo quando P è strettamente associato alla sintesi della biomassa steady-state qp è proporzionale a m che è uguale a D quindi qp è proporzionale a D D wash-out m La produttività Qp è pari e quindi cresce linearmente con D fino ad un certo valore poi decresce. Ancora una volta in batch la produttività è massima solo alla fine del processo, in continuo invece, raggiunto l’equilibrio con una D opportuna (pari a DM), durante tutta la fermentazione. DM

Produttività in continuo Prodotto Se P non è associato alla sintesi della biomassa Qp non è proporzionale a m che è uguale a D quindi qp non sarà legato a D La produttività sarà costante all’aumentare di D (fino a Dm) mentre la concentrazione all’equilibrio del prodotto sarà decrescente DM D wash-out

Mass balance Equations Steady-state Equations Continuo Mass balance Equations Steady-state Equations                                                                                                            Assuming Monod                                                                                                                                                                                     µ = D A mathematical model of a chemostat Assumptions in the model Several assumptions have been written into the derivation: The feed is assumed to be sterile. The reactor is assumed to be perfectly mixed such that the composition of the effluent is the same as that of the reactor. In addition, in the above equations: product formation is assumed to be growth associated. growth is assumed to follow the Monod model

DEVIAZIONI DALLA TEORIA DEL CHEMOSTATO Miscelazione non perfetta Adesione delle cellule alle pareti Substrato limitante fonte di N, usato per la produzione di polisaccaridi X Adesione delle cellule alle pareti del fermentatore D Substrato limitante fonte di C/energia, usato per il mantenimento

UTILITA’ DELLA COLTURA CONTINUA Mantenere le cellule in fase esponenziale per studi fisiologici Distinguere tra gli effetti dovuti ai cambiamenti di  e quelli dovuti ai cambiamenti ambientali Aumentare la produttività sia in termini di biomassa sia di prodotto associato alla biomassa Controllare meglio il processo: allo stato stazionario tutti i parametri restano costanti (richiesta O2, pH) per cui il controllo del processo prevede maggiore uniformità operativa Annullare quasi del tutto i tempi morti Consente l'uso di reattori di dimensioni minori rispetto ai reattori batch Spesso ha minori costi nel sistema di recupero

Flessibilità del Continuo Il processo continuo mostra una flessibilità superiore al batch perché permette di regolare e mantenere costante la velocità di sviluppo della biomassa e quindi anche di prodotto mediante una regolazione meccanica, cioè quella della portata F. Quando, con l’incremento di F, m tende a mmax e si può incrementare la produttività del sistema anche se a ciò corrisponde una utilizzazione sempre minore del substrato influente. Quando m tende invece a 0 si può massimizzare l'utilizzazione del substrato, anche se a questa corrisponde una produttività sempre minore. Le due ipotesi possono essere esemplificate ipotizzando nel primo caso la produzione di un metabolita primario di elevato valore commerciale, per la cui produzione lo spreco di substrato non metabolizzato in uscita dal reattore è ampiamente compensato dal valore del prodotto sintetizzato. Il secondo caso può essere esemplificato dalla depurazione biologica di un effluente il cui scopo non è la produzione di biomassa o di prodotto ma il consumo, o mineralizzazione, del substrato stesso: per raggiungere tale scopo è giustificato lo spreco di tempo necessario.

SVANTAGGI DELLA FERMENTAZIONE CONTINUA Limitata a prodotti associati alla crescita Può essere applicata se il microrganismo ha specifiche caratteristiche ( buona stabilità genetica, capacità di sintetizzare il prodotto rapidamente) Maggiore possibilità di contaminazione Maggiore possibilità di mutazioni del microrganismo impiegato a causa dei lunghi tempi di fermentazione

La fermentazione continua multistadio V1 S1, X1, P1 F2 S2, X2, P2 V2 S0 Trascurando le cellule che vanno incontro a morte e posto V1=V2, F1=F2 e D1=D2 si ha: steady-state

La fermentazione continua multistadio V1 S1, X1, P1 F2 S2, X2, P2 V2 S0 l valore di m2 relativo alla velocità di sviluppo della biomassa nel secondo stadio risulta inferiore a quella del primo stadio in cui è m = D poiché il valore tra parentesi è <1. le velocità di sviluppo m in un sistema multistadio tendono a diminuire nei singoli reattori

La fermentazione continua multistadio Trascurando la quota di substrato utilizzata per il mantenimento delle cellule nel 2° stadio, e supponendo per semplicità che non venga sintetizzato alcun prodotto, il consumo istantaneo di substrato in un doppio stadio è espresso da F F1 V1 S1, X1, P1 F2 S2, X2, P2 V2 S0 Steady-state Si può dimostrare che la produttività complessiva di una cascata è in aumento con l'aumentare del numero dei reattori: infatti già a partire da due reattori si dimostra superiore a quella ottenibile da uno singolo.