Ploidia e ciclo cellulare ploidia = 2n: 2n = 4; contenuto di cromatina = 4C (replicata) 2n = 4 2n = 4; contenuto di cromatina = 2C (non replicata) 2n = 4; contenuto di cromatina = 4C >X> 2C

Mitosi meccanica strutture coinvolte e funzioni regolazione (check-point).

Divisione per mitosi: cellule somatiche linea germinale: solo cellule goniali (spermatogoni e oogoni) (cellule proliferanti o inducibili alla proliferazione) REPLICAZIONE MITOSI (cariocinesi) CITOCINESI

MITOSI “APERTA” e MITOSI “CHIUSA” Negli eucarioti inferiori, come ad esempio nel lievito il cui genoma è < 1% rispetto a quello dei mammiferi ed il ciclo vitale si svolge allo stato aploide, il ciclo cellulare è di breve durata (quasi come nei batteri). Schizosaccharomyces pombe e Saccharomyces cerevisiae

Negli eucarioti superiori: mitosi aperta Negli eucarioti inferiori la mitosi è molto “primitiva”: mitosi chiusa. A differenza degli eucarioti superiori, la membrana nucleare non si dissolve, i microtubuli si formano all’interno del nucleo e sono attaccati ai “corpi polari” del fuso. I cromosomi mitotici condensano, ma non sono distinguibili (ad eccezione del lievito a fissione, Schizosaccharomyces pombe); essi rimangono a contatto con la membrana nucleare, ancorati attraverso i loro cinetocori “rudimentali”. La mitosi di questi organismi è chiamata mitosi “chiusa”, a differenza della mitosi “aperta” degli eucarioti superiori.

A differenza della maggior parte degli eucarioti pluricellulari, nei protisti si osserva una varietà di situazioni diverse, che riguardano : il ruolo della membrana nucleare; la disposizione spaziale del fuso mitotico; la localizzazione dei centri di nucleazione dei microtubuli. La membrana nucleare può rimanere preservarsi integra (a-d), oppure dissolversi parzialmente (e) o completamente (f). Si distinguono così mitosi rispettivamente di tipo chiuso, semiaperto (d, e) e aperto. Il fuso mitotico può presentarsi sia unico con assetto bipolare e simmetria assiale (c, e, f), sia duplice con disposizione eccentrica (a; b, d) dando rispettivamente luogo a ortomitosi e pleuromitosi. I centri di nucleazione dei microtubuli possono essere localizzati sia internamente sia esternamente al nucleo, distinguendosi rispettivamente tra mitosi intranucleari (b-c) ed extranucleari (a). a b c d e f

Negli eucarioti inferiori Negli eucarioti superiori Durante la MITOSI: Negli eucarioti inferiori Negli eucarioti superiori membrana nucleare presente assente Microtubuli e fuso interni al nucleo occupano l’intero volume cellulare cromosomi condensati, ma non distinguibili molto condensati; uniche strutture visibili cinetocori possono legarsi ai microtubuli e alla membrana nucleare legati ai microtubuli

Formazione dei corpi polari: in fase M (A) o in S (B) In Schizosaccharomyces pombe (lievito a fissione): fasi G1, S e G2 normali; cromatina/cromosomi visibili; i microtubuli si formano all’interno del nucleo, attaccati ai corpi polari; citodieresi per formazione di un setto di divisione (o “piastra cellulare”). In Saccharomyces cerevisiae (lievito a gemmazione): G2 anomala; i microtubuli si formano fuori del nucleo per poi legarsi ai corpi polari nel nucleo.

Eucarioti superiori MITOSI e CITOCINESI segregazione cromatidica; formazione dei 2 nuclei figli. divisione della cellula in 2 strutture distinte (compartimentazione). Funzioni svolte da 2 distinte strutture citoscheletriche: Fuso mitotico: fasci di microtubuli (tubulina a e b) Anello contrattile: fibre di actina/miosina-II Funzione di ripartizione equa nelle due cellule figlie delle 2 copie di: genoma (cromatidi fratelli) centrosomi Produzione di 2 strutture di uguale dimensione e ripartizione di organelli e altre strutture per distribuzione casuale

La fase M è divisibile in 5 stadi, cui segue la citocinesi. Profase: i cromosomi iniziano ad essere visibili (condensazione); Prometafase: si disgrega la membrana nucleare: i cromosomi entrano in “contatto” con le fibre del fuso; Metafase: si osserva l’allineamento dei cromosomi in piastra equatoriale del fuso (congressione) ; Anafase: inizia la segregazione dei cromatidi fratelli con un rapido movimento di trazione verso i poli opposti; Telofase: si ricostituisce la membrana nucleare intorno alle masse di cromatina presenti intorno a ciascuno dei poli del fuso. 1 1 2 3 4 4 5 Cellule di polmone di tritone in coltura (Rieder et al., in: Biol. Mol. Cellula, Zanichelli)

La transizione tra G2 e profase non è netta: 1) la condensazione della cromatina è progressiva e continua; 2) la disgregazione del nucleolo è graduale; 3) la separazione dei centrosomi inizia già durante la G2; 4) la disorganizzazione del citoscheletro (fasci di microtubuli) e la sua riorganizzazione per costruire il fuso bipolare ha inizio mentre la membrana nucleare è ancora intatta.

(1) [1) fosforilazione della lamina nucleare] L’ingresso in prometafase è netto, per la disgregazione della membrana nucleare, che si riorganizza in piccole vescicole, disposte intorno al fuso e non distinguibili dal reticolo endoplasmatico (anch’esso riorganizzato). Ora i cromosomi sono liberi di interagire con i microtubuli poiché si trovano immersi nella stessa matrice; l’interazione avviene tra le proteine del cinetocore e le estremità + dei microtubuli che riescono a “catturarli”. Questi sembrano esercitare sui cromosomi una trazione continua in direzione opposta (“in su e in giù”) lungo l’asse del fuso.

La trazione dei microtubuli sui cromosomi continua fino alla loro congressione in piastra: in metafase i cromosomi sono tutti allineati e ciascuno posizionato con il centromero disposto sul piano equatoriale. A questo punto si verifica il momento di “massima tensione” esercitata sui cinetocori fratelli. Ogni cromosoma è legato alle fibre del fuso su entrambi i lati (cinetocori fratelli) da fibre distinte, che continuano la loro trazione, ciascun verso il proprio polo. La tensione è dovuta ad un “equilibrio dinamico” tra spinte di pari intensità in direzioni opposte.

L’inizio dell’anafase è improvviso: è attivato da un segnale specifico (check point mitotico) che parte nel momento in cui si ottiene un perfetto allineamento di tutti i cromosomi in piastra equatoriale (la tensione è equivalente ai 2 cinetocori fratelli): nel momento di massima tensione si raggiunge un equilibrio tra le 2 forze di trazione; questo segnale attiva il processo di segregazione tra i cinetocori fratelli. Il movimento dei cromatidi è sincrono e rapido (1mm/min) ed è dovuto all’accorciamento dei microtubuli del cinetocore,

I cromosomi figli (ex cromatidi) segregati ai poli iniziano a perdere l’ordinato livello di condensazione. I microtubuli del cinetocoro scompaiono. Il fuso continua ad allungarsi per continua crescita dei microtubuli polari. Inizia a ricostituirsi la membrana nucleare intorno a ciascun gruppo di cromosomi. I nucleoli cominciano a riformarsi. Sulla parte interna della membrana plasmatica inizia a formarsi l’anello contrattile, in corrispondenza della fascia di sovrapposizione dei microtubuli polari.

CITOCINESI Il citoplasma viene diviso in due, come nel processo di segmentazione (cellule animali). In corrispondenza dell’anello contrattile la membrana viene tirata in dentro, formando un solco di segmentazione, che si approfondisce fino a toccare la zona di sovrapposizione dei microtubuli, o corpo intermedio, che si assottiglia sempre di più per poi scomparire.

La divisione cellulare dipende dalla duplicazione del centrosoma: costituito da un’area di materiale pericentriolare poco definito (matrice del centrosoma) generalmente associato ad una coppia di centrioli (cellule animali). È il principale centro di organizzazione dei microtubuli (MTOC: MicroTubule Organizing Center). Nella maggior parte delle cellule animali, durante l’interfase, i microtubuli vengono nucleati dalla matrice del centrosoma. Questi si estendono verso la periferia della cellula (estremità +), mentre le loro estremità (–) sono rivolte (attaccate) al centrosoma. I centrioli, generalmente in coppia e associati alla matrice del centrosoma, non sono indispensabili per la nucleazione di microtubuli: sembra quindi che la matrice del centrosoma sia la struttura principale (le cellule vegetali sono prive di centrioli).

CICLO DEL CENTROSOMA La replicazione dei centrioli-centrosomi è accoppiata alla replicazione del DNA In tarda G1: separazione dei centrioli-centrosomi; in S/G2: loro replicazione (sono ancora uniti); in profase: inizio della separazione in cui ciascun centrosoma diventa un distinto centro di organizzazione (MTOC) che nuclea una serie radiale di MT (ASTER); gli aster migrano verso i poli opposti del nucleo formando il fuso: in prometafase il fuso è pronto.

Per assicurare l’eredità di tutti gli organelli citoplasmatici nelle 2 cellule figlie sono adottate due strategie diverse: 1. alcuni organelli come i mitocondri e i cloroplasti, capaci di duplicarsi autonomamente, si moltiplicano prima della fase M per poi essere ripartiti in numero casuale ma equivalente. 2. Altre strutture come il Golgi e il reticolo endoplasmatico (ER) si riducono un una serie di frammenti e vescicole più piccole: in tal modo aumenta il numero di particelle, diminuisce il loro volume, rendendo più uniforme e quantitativamente bilanciata la loro ripartizione casuale. Inoltre le vescicole di ER sembra siano associate ai microtubuli del fuso. I centrioli/centrosomi vengono ereditati in unica copia, come “parte integrante” della struttura che segrega con il genoma. La loro eredità e duplicazione sono strettamente legate a quella del genoma: i processi di duplicazione e ripartizione sono associati reciprocamente.

Interazione fra estremità in crescita (+) dei microtubuli polari, stabilizzata da proteine motrici (allungamento del fuso mitotico). Microscopia a contrasto di fase: fuso mitotico (metafase).

Fuso mitotico: dalla profase precoce alla prometafase è “in costruzione”; nel corso dello svolgimento della mitosi, dalla metafase all’ana-telofase, si sovrappongono due processi: 1) anafase A: accorciamento dei microtubuli e trazione dei cromatidi verso i poli; 2) anafase B: allungamento del fuso (asse maggiore).

i poli si respingono tra loro, distanziandosi. 1: scorrimento tra i microtubuli di poli opposti sovrapposti (forza generata centralmente): i poli si respingono tra loro, distanziandosi. Accorciamento dei microtubuli del cinetocoro e movimento del cromatidi fratelli verso i poli: le forze sono generate soprattutto ai cinetocori. 2: forza di trazione sui poli (verso le membrane plasmatiche) che li separarno. Crescita dei microtubuli polari alle estremità +.

Late metaphase: The centrosomes have moved to the poles of the cell and have established the mitotic spindle. The chromosomes, in light blue, have all assembled at the metaphase plate, except for one. An image of a lung with fluorescent dyes undergoing mitosis, specifically at the boundary between late metaphase/early anaphase. Green= microtubules of the spindle; red = membrane and some components of the cytoplasm; light blue are the chromosomes.

trattamenti con veleni del fuso mitotico (es trattamenti con veleni del fuso mitotico (es. colcemid, colchicina) allungano la durata della mitosi. 1. Concentrazioni basse causano la disorganizzazione di alcune fibre del fuso mitotico RITARDO MITOTICO; +/- ANEUPLOIDIA CONSEGUENZA: ritardo di un cromosoma ad allinearsi in piastra equatoriale con alta probabilità di esclusione; 2. Concentrazioni intermedie causano la disorganizzazione di molte fibre del fuso mitotico CONSEGUENZA: RITARDO MITOTICO; ANEUPLOIDIE MULTIPLE più cromosomi non riescono ad ancorarsi alle fibre del fuso, rimanendo delocalizzati rispetto al piano equatoriale; 3. Concentrazioni elevate inducono la totale disorganizzazione del fuso BLOCCO MITOTICO: POLIPLOIDIA CONSEGUENZA: tutti i cromosomi rimangono dispersi all’interno della cellula (non esiste più un fuso funzionale)

Tutto il suo DNA, durante la fase S; La cellula in G2: Prima dell’ingresso in mitosi la cellula deve avere completato la replicazione di: Tutto il suo DNA, durante la fase S; centrosoma (e centrioli) a partire dalla fine della fase S e in G2. Questi processi sono controllati da altri segnali della progressione del ciclo cellulare: check point in G2.

in M: per l’ingresso in anafase I principali punti di controllo della progressione del ciclo cellulare, o ‘check point’ sono: in M: per l’ingresso in anafase in G2: prima dell’ingresso in mitosi in G1: prima dell’ingresso in fase S

Se i segnali danno l’avvio per l’ingresso verso la fase S la cellula è impegnata senza ritorno verso la MITOSI!

Il ciclo può arrestarsi in G1 se: … o arrestarsi in G2 se: 1. La cellula non è pronta ad affrontare la S, per ridotto accrescimento e mancanza di nutrienti, 1. non è stato replicato tutto il DNA; 2. non è garantita l’integrità del genoma; 3. L’ambiente è “sfavorevole”. 2. L’ambiente è “sfavorevole. Punto di controllo in G2: MPF (Mitosis Promoting Factor) 3. Sono presenti lesioni al DNA. Condizioni ‘limite’ determinano un arresto ‘permanente’: l’ingresso in G0. Punto di controllo in G1: START-CHINASI ..o arrestarsi in metafase: Punto di controllo in M: APC (Anaphase Promoting Complex) finchè tutti i cromosomi non sono allineati in piastra equatoriale

tutti i cromosomi in piastra equatoriale! Punto di controllo in M (mitosi): tutti i cromosomi in piastra equatoriale! Controllo in METAFASE In presenza di cromosomi ‘in ritardo’ durante il processo di congressione in piastra, la mitosi subisce un rallentamento.

la cui funzione principale è di innescare la transizione L’APC è una ubiquitin ligasi la cui funzione principale è di innescare la transizione metafase => anafase In tal modo l’APC ‘marca’ le proteine specifiche da degradare, che quindi rappresentano il suo substrato. Le principali proteine sono la securina e le cicline M e S, che così vengono poi degradate. Dalla degradazione della securina viene rilasciata la separasi, una proteasi che a sua volta innesca il taglio della coesina, il complesso proteico che tiene insieme i cromatidi fratelli. (Fino alla metafase i ctd fratelli sono tenuti insieme da complessi di coesina intatti). Appena la coesina è degradata i ctd fratelli diventano liberi di muoversi verso i poli opposti. L’ubiquitinazione delle cicline mitotiche (per la loro degradazione) causa anche l’inattivazione dei complessi M-CdK (mitotic CdK) promuovendo l’uscita dalla mitosi e l’avvio della citocinesi. L'APC / C gioca anche un ruolo fondamentale nel mantenimento del metabolismo della cromatina, in particolare in G1 e G0, e svolge un ruolo chiave nella fosforilazione di H3 attraverso la distruzione delle chinasi Aurora A.

regolazione del ciclo cellulare e cancro Il controllo della divisione cellulare e lo sviluppo di un tessuto sono processi molto complessi: il cancro è una malattia in cui la regolazione del ciclo cellulare viene persa, insieme al normale comportamento e alla crescita cellulare. p53 è una proteina che blocca il ciclo cellulare se il DNA è danneggiato: in presenza di lesioni al DNA i suoi livelli aumentano, permettendo l’intervento dei sistemi di riparazione, ma se la frequenza di lesioni è elevata viene attivato il processo apoptotico. Mutazioni di p53 rappresentano la condizione più frequente nella trasformazione neoplastica. Un caso estremo di questo è la sindrome Li Fraumeni: in individui affetti un difetto genetico in p53 conduce ad una elevata frequenza di insorgenza del cancro.

p27 è un’altra proteina che legandosi alle cicline e alle cdk blocca l’entrata nella fase S. Da ricerche su questi meccanismi di segnalazione è stato suggerito che la prognosi di cancro al seno può essere determinata dai livelli di p27. Livelli ridotti di p27 predicono una prognosi sfavorevole nelle pazienti con cancro al seno. La duplicazione dei centrosomi è controllata da CDK2/ciclina E e ciclina A, ed è inibita da p21 e p27. Risultati sperimentali suggeriscono che l’instaurazione di meccanismi di instabilità cromosomica in seguito all’induzione di danni al DNA sia prevenuta dall’accumulo di p27 che induce la soppressione dell’amplificazione dei centrosomi. L’accumulo di p 27 sopprime l’amplificazione dei centrosomi e previene l’instaurazione di meccanismi di instabilità cromosomica

MPF: ciclina mitotica + cdc2 Ciclo del centrosoma: anomalie nella regolazione MPF: ciclina mitotica + cdc2 Ciclina B (ciclina mitotica): permette l’ingresso in fase M. Nella cellula la ciclina B è presente anche legata saldamente ai centrosomi. L’ipotesi è che riconosca i componenti del centrosoma e in questa sede recluti la cdc2, formando l’MPF che, una volta attivato, induce la fosforilazione di molte proteine. p53 (oncosoppressore) È dimostrato anche che la proteina p53 (oncosoppressore) localizza anche sul centrosoma e sembra essere coinvolta nella regolazione della sua duplicazione: l’inattivazione di p53, per perdita o per mutazione, è associata alla perdita di regolazione della duplicazione del centrosoma e alla sua amplificazione.

Cambiamenti morfologici dipendenti dagli eventi di fosforilazione indotti dall’MPF: Condensazione mitotica dei cromosomi; Disgregazione della membrana nucleare; Frammentazione del reticolo endoplasmatico; Perdita di adesione con l’esterno (con altre cellule o con la matrice extracellulare / substrato solido); Riorganizzazione del citoscheletro.

Le principali manifestazioni della divisione cellulare sono: Avviene per un’estesa fosforilazione degli istoni H1 (fino a 6 gruppi fosfato/istone). L’istone H1 è presente in concentrazione 1:1 con i nucleosomi. Condensazione cromosomica: Struttura bipolare composta di microtubuli e proteine associate. Recluta i cromosomi presenti, li allinea su 1 piano perpendicolare alla sua lunghezza e separa i 2 cromatidi di ciascun cromosoma trasportandoli ai poli opposti. 2) Formazione del fuso: Struttura composta di actina e miosina II. Si forma poco dopo l’inizio dell’anafase, sotto la membrana plasmatica, perpendicolarmente all’asse del fuso. In anatelofase si contrae formando un solco di divisione. 3) Formazione dell’anello contrattile