CORSO DI LAUREA INFORMAZIONE SCIENTIFICA SUL FARMACO E SUI PRODOTTI DIAGNOSTICI Biochimica clinica Prof.ssa Barbara Izzo Dipartimento di Medicina Clinica e Chirurgia CEINGE-Biotecnologie Avanzate 081-3737869 izzob@dbbm.unina.it

Cellulare e molecolare Orari ORE LUNEDI MARTEDI MERCOLEDI GIOVEDI VENERDI SABATO 9.00 Farmacologia Cellulare e molecolare Aula 9 10.00 11.00 Biochimica Clinica Fisiologia Umana Aula 7 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00

ARTICOLAZIONE DEL CORSO lezioni frontali Materiale didattico: diapositive delle lezioni Valutazione finale: prove intercorso esame orale

DEFINIZIONE di BIOCHIMICA CLINICA Scienza applicata che studia l’effetto di una patologia o di una terapia farmacologica sui processi biochimici degli organi, dei tessuti e dei fluidi biologici La biochimica clinica permette di valutare la presenza e la quantità di composti (analiti) o delle loro proprietà che servono per prevenire, diagnosticare o curare uno stato di malattia

Biochimica/Biochimica clinica Attraverso il comportamento di proteine, enzimi, elementi chimici e cellulari studia le vie metaboliche nei fenomeni fisiologici e patologici per ricavarne comportamenti e leggi Studia il linguaggio della vita Biochimica clinica È volta allo studio di processi patologici ed utilizza la misura delle eventuali alterazioni, di proteine, enzimi, elementi chimici e cellulari, riscontrabili nei campioni biologici per raccogliere dati e informazioni che servono a confermare o meno l’ipotesi diagnostica del clinico È il settore della medicina di laboratorio in cui le conoscenze biochimiche vengono utilizzate per la caratterizzazione di processi patologici La Biochimica clinica è la scienza che fornisce informazioni ottenute con metodi chimici, fisici o biologici su tessuti, liquidi biologici o su materiali connessi alla patologia ai fini della prevenzione, della diagnosi, del monitoraggio, della terapia e del decorso della malattia

si basa sulla ricerca pura e sulla ricerca applicata La Biochimica Clinica è una disciplina sperimentale Nasce in laboratorio si basa sulla ricerca pura e sulla ricerca applicata Può essere condotta in vivo, in vitro Viene utilizzata: Per diagnosticare la presenza di malattie Per monitorare la terapia Per la ricerca delle basi molecolari delle malattie

La Biochimica clinica nella pratica clinica 1° contributo Profili biochimici di organo e di tessuto 2° contributo Malattie spiegabili su base puramente biochimica: - difetti enzimatici - alterazioni strutturali di componenti proteiche In tali casi l’esistenza della malattia è provabile mediante una determinazione di laboratorio 3° contributo Classificazione nosografica: identificazione e classificazione delle varie forme di una stessa patologia (es. diabete) 4° contributo Interpretazione di dati statisticamente significativi sotto l’aspetto medico, basandosi su cognizioni di fisiopatologia e di clinica, (concetto di probabilità statistica di malattia)

Principali processi metabolici di interesse chimico-clinico Bilancio idroelettrolitico e pressione osmotica Equilibrio acido-base e gas del sangue Metabolismo del calcio, dei fosfati e del magnesio Metabolismo del ferro e degli elementi oligominerali Metabolismo dei carboidrati Metabolismo dei lipidi e delle lipoproteine Metabolismo delle proteine del plasma Metabolismo degli enzimi Aminoacidopatie Metabolismo dell’acido urico e delle purine Sintesi del gruppo eme e delle porfirine Catabolismo del gruppo eme e bilirubina

Il dato di laboratorio è un segno che contribuisce a distinguere tra “sano” e “malato” La valutazione della presenza di un analita in presenza di una patologia fa si che esso rappresenti un marcatore specifico da seguire

MARCATORI ENDOGENI MARCATORI DI FUNZIONE MARCATORI DI LESIONE

MARCATORI DI FUNZIONE Comprendono tutte quelle sostanze presenti a vario titolo nei tessuti e/o nei fluidi extracellulari: Metaboliti (enzimi, ormoni, citochine, immunoglobuline). Sono di solito presenti in quantità minime, per aumentare in seguito a stimoli fisiologici (es. ormoni) o patologici (citochine, Immunoglobuline). L’interpretazione dei dati forniti da questi marcatori può essere di notevole utilità nell’individuare la carenza ad esempio di specifici enzimi.

MARCATORI DI LESIONE Sono sostanze che fanno parte della normale struttura delle cellule di un tessuto od organo che in seguito ad un evento lesivo, vengono rilasciati nei fluidi extracellulari Essi forniscono quindi un’informazione immediata sulla struttura biologica danneggiata, con specificità a livello cellulare e/o molecolare

MARCATORI DI LESIONE :esempio La presenza della lattico deidrogenasi nel plasma sta ad indicare un danno cellulare, poichè questo enzima è normalmente intracellulare; L’analisi delle sue isoforme consentirà di stabilire se esso deriva ad es. dal miocardio (LDH1 e LDH2) o dal fegato (LDH5). Talvolta tali marcatori possono dare informazioni sulla gravità e sull’estensione del danno.

Non sempre la distinzione tra marcatori di funzione e di lesione è sempre cosi netta: Esempio: I marcatori tumorali sono di solito sostanze esistenti nei tessuti e/o nei liquidi extracellulari quale espressione della presenza nell’organismo di una malattia neoplastica in atto (metaboliti, ormoni, proteine prodotti di oncogeni). Quindi non tutti i segnali biochimici o fisiopatologici lanciati da una semplice alterazione funzionale o da un processo patologico in atto rispondono ai requisiti di un marcatore molecolare. In altri termini una determinata sostanza, per essere utilizzata come indicatore deve possedere alcuni requisiti essenziali

MARCATORE IDEALE (I) Essere presente nel campione biologico in quantità idonee per poter essere rilevata con le tecniche di laboratorio disponibili Essere dosabile con metodiche tecnicamente valide e atte a conferire caratteristiche di sensibilità, specificità e affidabilità (precisione, accuratezza). Essere dotato di un’adeguata sensibilità e specificità diagnostica ovvero essere assente nei soggetti sani o, se presente anche nei soggetti sani, raggiungere livelli significativamente superiori rispetto a quelli normali (idoneo “cut off”). Essere rilevabile precocemente (idonea “finestra diagnostica”) in modo da fornire indicazioni affidabili già in una fase preclinica della malattia.

MARCATORE IDEALE (II) Essere correlato con la gravità della malattia Essere sensibile all’efficacia dei trattamenti in modo da poter essere utilizzato nel corso del monitoraggio della terapia. Essere basato su procedure minimamente invasive, ben accette dal paziente, veloci, ed esibire un rapporto ottimale costo/benefici.

MARCATORE IDEALE (III) Molti marcatori attualmente in uso forniscono una buona affidabilità analitica e predittività tali da consentirne un adeguato uso clinico Le tecniche biochimico cliniche possiedono livelli di sensibilità e specificità superiori ai metodi convenzionali. Disponibilità di ambienti ed attrezzature adeguate, operatori con elevato livello di competenza ed aggiornamento Non bisogna dimenticare però che l’iter diagnostico per inquadrare una malattia è sempre prima rappresentato dall’anamnesi, dall’esame obiettivo e va definito caso per caso Affidabilità analitica: un metodo che sia al contempo accurato, preciso, sensibile selettivo Per Predittività o valore predittivo positivo si intende la probabilità che un soggetto positivo ad un test di screening sia effettivamente malato

IL CICLO ANALITICO Controllo di Qualità Fase Pre-analitica Fase Post-analitica

Dal campione biologico al referto Prelievo Richiesta Accettazione Indagini di laboratorio (esecuzione del test diagnostico) Interpretazione del risultato Refertazione Fase Pre-analitica Fase Analitica Per fase di accettazione intendiamo tutte quelle operazioni tecniche necessarie ad estrapolare dal campione biologico (sangue, tessuto , liquido amniotico, saliva) il tipo cellulare di interesse su cui effettuare l’indagine molecolare Fase Post-analitica

Percorso unidirezionale dell’iter diagnostico Fase analitica (test diagnostico) Fase Post-analitica (controllo di qualità, interpretazione del risultato) Fase preanalitica (prelievo, richiesta , accettazione) Refertazione

Diagnostica molecolare CAMPIONI BIOLOGICI Biochimica classica Diagnostica molecolare

Campioni biologici Modalità di prelievo Sangue periferico Prelievo venoso Sangue midollare Puntura lombare Villi coriali Villocentesi Amniociti Amniocentesi Cellule da tessuto Biopsia Ossa e denti Bulbi capilliferi …

Il materiale biologico deve essere etichettato con un pennarello indelebile o con bar code

È importante verificare…. l’idoneità del campione la corretta compilazione della richiesta la corrispondenza campione-richiesta

Richiesta degli esami di laboratorio e notizie relative al paziente Per eseguire le analisi biochimiche è necessario che il laboratorio venga fornito: del campione, siglato e raccolto in maniera idonea in relazione all’esame richiesto del modulo di richiesta dettagliato ed interamente compilato

Richiesta:Notizie relative al paziente Nome, cognome, provenienza, età, sesso Sospetto diagnostico ed altre notizie cliniche Data del prelievo Data di arrivo del campione nel laboratorio Tipo di campione Eventuale fase della malattia Albero genealogico (in caso di malattie genetiche a trasmissione ereditaria)

Il modulo di richiesta deve essere riposto in una tasca separata della busta che contiene il materiale biologico SACCHETTI DOPPI PER TRASPORTO di PROVETTE Sacchetti realizzati in due parti, la prima con chiusura a “clip” per contenere le provette, la seconda a tasca aperta per contenere le richieste di esame. In caso di apertura accidentale della provetta o del contenitore non si hanno perdite di liquidi biologici (garantendo in tal modo la sicurezza dell’operatore) ed al tempo stesso si preserva la richiesta d’esame inserita nell’apposita tasca.

del campione biologico Accettazione del campione biologico L’accettazione rappresenta l’insieme di procedure da adottare per ottenere dal paziente un campione di materiale rappresentativo da utilizzare per effettuare successivamente l’analisi vera e propria.

Al momento dell’accettazione del campione biologico in laboratorio è importante: verificare se sono state rispettate tutte le misure previste nelle manipolazioni preanalitiche

Standardizzazione del prelievo del campione biologico (I) E’ una delle fasi più importanti del processo analitico Errori di campionamento rientrano nella cosiddetta variabilità preanalitica E’ necessario quindi seguire alcuni accorgimenti in fase di raccolta del campione

Standardizzazione del prelievo del campione biologico (II) Detersione della sede in cui effettuare il prelievo con alcool al 70% E’ noto che “il prelievo va effettuato sul paziente riposato e a digiuno da almeno 6-8 ore”, ma ci sono numerose condizioni che possono influenzare i risultati analitici Alimentazione Postura Attività fisica Azione farmacologica e metabolica Ritmi cronobiologici Metodo di prelievo

Alimentazione Digiuno In fase post-prandiale: la glicemia e la lipemia aumentano la potassiemia e la fosforemia diminuiscono la glicemia aumenta (infatti è possibile valutare la tolleranza al glucosio in fase post-prandiale); la potassiemia e la fosforemia diminuiscono (a causa dei processi metabolici di utilizzazione del glucosio)

Dieta Apporto glucidico: la prova di tolleranza al carico glucidico deve essere programmata, in quanto nei giorni che precedono la prova il paziente deve assumere quantità equilibrate di glucidi Apporto proteico e lipidico: in soggetti sani l’azotemia non aumenta in relazione al carico proteico, mentre la concentrazione di trigliceridi è inflenzata da variazioni dietetiche. Tuttavia, per la determinazione del metabolismo basale, il paziente deve sottoporsi ad un regime di restrizione proteica per almeno tre giorni

Postura Riposo a letto (pz. degenti) e ortostatismo (pz ambulatoriali) influenzano la concentrazione di numerose sostanze In ortostatismo si ha una concentrazione ematica più alta, rispetto al paziente degente Esempio: risultano più ELEVATI NEI PZ AMBULATORIALI: Emoglobina Proteine totali Sostanze legate a proteine Calcio, colesterolo, bilirubina

POSTURA e gravidanza l’escrezione degli estrogeni è aumentata in posizione clinostatica parallelemente alla modificazione del flusso plasmatico renale al contrario in posizione ortostatica si ha un netto aumento nell’escrezione della noradrenalina.

Attività fisica Il prelievo deve essere eseguito al mattino, in condizioni di riposo in quanto l’attività fisica intensa può influenzare alcuni analiti, come gli enzimi localizzati prevalentemente nella muscolatura scheletrica. Alcuni esempi: CPK, aspartato aminotransferasi, aldolasi, lattatodeidrogenasi Ammoniaca, ac lattico, ac piruvico Catecolamine urinarie (esercizio fisico prolungato)

D’altro canto, l’immobilizzazione completa determina un processo di demineralizzazione del tessuto scheletrico con aumento dell’escrezione urinaria del calcio, del fosforo e della idrossiprolina.

Ritmi cronobiologici Per alcuni analiti si registra una variazione di concentrazione ritmica; tali variazioni possono presentarsi per periodi inferiori alle 24 h (ultradiano) o per periodi più lunghi, oltre le 24h (infradiano). Fra i ritmi infradiani si possono ricordare quelli di 7 giorni circa, un mese e un anno. Il ritmo più comune è quello circadiano, che ha come sincronizzatore più comune l’alternanza luce-oscurità, sonno-veglia, assunzione di cibo, ecc. La VES, i livelli di ACTH, del cortisolo, delle gonadotropine, della sideremia, della cloruremia, della calcemia, della 5-idrossitriptamina, l’escrezione urinaria di catecolamine, sodio, potassio e fosfati presentano variazioni cronobiologiche.

Variazione ritmica circadiana VES Nel sangue: ACTH Cortisolo Gonadotropine Sideremia Cloruremia Calcemia 5-idrossitriptamina Nelle urine: Catecolamine Sodio Potassio fosfati

Azione biofarmacologica e metabolica Nelle ore precedenti al prelievo i trattamenti farmacologici devono essere sospesi Interferenza diretta di natura fisica o chimica sulla reazione analitica per l’azione farmacologica, immunologica o tossicologica dei medicamenti Ad esempio: la vit. A e la riboflavina contengono pigmenti gialli che vengono assorbiti nel tratto intestinale, possono alterare la misura della bilirubina

Naturalmente non devono essere sospesi i farmaci che sono stati prescritti dal medico per ottenere un effetto metabolico specifico, la modificazione indotta sul dato di laboratorio è attesa dal medico curante e come tale giustamente interpretata. Ad esempio: insulina i diuretici alterano la concentrazione degli elettroliti

Raccolta del campione biologico Possono essere oggetto degli esami di laboratorio tutti i campioni biologici (fluidi, tessuti, frammenti bioptici) purchè siano rappresentativi dei sistemi da investigare Il tipo di campione dipende dalle indagini da eseguire: Sangue venoso, siero o plasma Sangue arterioso Urine Feci Fluido cerebrospinale (LCS) Tessuto o cellule Aspirato (fluido della pleura, asciti, fluido sinoviale, fluido intestinale…) Liquido amniotico

Campioni di sangue Il sangue intero contiene la componente corpuscolata (eritrociti, leucociti, piastrine) e la componente acquosa con i soluti disciolti. Il plasma si ottiene da sangue intero prelevato con anticoagulante, separandolo dagli elementi corpuscolati mediante centrifugazione. Contiene per il 90% acqua e per il 10% i soluti disciolti (proteine, metaboliti, elettroliti, minerali, ormoni, ecc.). Il siero si ottiene dal sangue intero senza aggiunta di anticoagulanti. Esso, quindi, è privo di fibrinogeno. Il non corretto utilizzo degli anticoagulanti è una delle più frequenti cause di errore preanalitico il plasma si ottiene per centrifugazione da un campione di sangue intero a cui è stato aggiunto un anticoagulante ( per esempio, citrato, eparina) immediatamente dopo il prelievo. Il plasma può essere congelato per successive analisi. Il siero ha una composizione simile a quella del plasma, ma non contiene i fattori di coagulazione, poichè si ottiene lasciando coagulare il campione di sangue prima della centrifugazione. Per i test della coagulazione tutti i fattori coinvolti nella coagulazione devono essere preservati, quindi il siero non può essere utilizzato. Bisogna sottolineare che rispetto al siero il plasma ha emolisi inferiore.

Se si raccoglie il sangue in una provetta che non contiene anticoagulanti, e si permette la formazione del coagulo, si può ottenere, dopo centrifugazione, un campione di siero. siero plasma coagulo Se il sangue è raccolto in una provetta contenente un anticoagulante, ed es. eparina, dopo centrifugazione il supernatante è costituito da plasma.