Biotecnologie Il DNA ricombinante

INGEGNERIA GENETICA O TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE Nasce negli Stati Uniti nei primi anni ’70, grazie agli studi sui microrganismi, in particolare Escherichia coli. La maggior parte dei metodi utilizzati per studiare e manipolare il DNA utilizza i batteri, grazie alla scoperta dei Plasmidi e degli Enzimi di Restrizione, strumenti chiave della clonazione genica.

INGEGNERIA GENETICA O TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE E’ una tecnica che viene utilizzata per: Per ottenere frammenti specifici di DNA in grandi quantità; Studiare la sequenza di determinati frammenti genici; Identificare specifiche sequenze geniche nei cromosomi; Studiare le modalità di trasmissione e regolazione genica; Creare piante ed animali transgenici (OGM); Diagnosticare e curare malattie genetiche

INGEGNERIA GENETICA O TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE E’ dunque una tecnica che utilizza i batteri in particolare l’ Escherichia coli Il DNA di un batterio è raccolto in un unico cromosoma circolare. In alcune situazioni specifiche, un tratto di DNA può essere scambiato e trasferito come caratteristica fenotipica da un organismo ad un altro uguale, ricordando il concetto Mendelliano di trasmissione di un GENE. Molti batteri, come E. coli, possono essere dotati anche di un DNA circolare a doppia elica, molto più piccolo del cromosoma (~1:1000): il plasmide. Può essere presente anche in numerose copie. In condizioni favorevoli opportune, un plasmide libero entra con facilità in un batterio e può anche successivamente uscirvi. I plasmidi sono, dunque, capaci di spostarsi tra le cellule influendo sulla variabilità genetica.

Le funzioni del DNA Plasmidico Queste molecole sono dotate di un'origine per la replicazione e sono molto simili a dei cromosomi batterici, ma sono più piccole e non sono strettamente necessarie alla vita del batterio. I plasmidi portano dei geni in singola copia, che rappresentano un corredo genetico aggiuntivo per il batterio che ne possiede, e possono quindi fornirgli delle caratteristiche specifiche. Dei geni comunemente contenuti nei plasmidi sono quelli che conferiscono al batterio la resistenza agli antibiotici. I plasmidi possono quindi essere replicati all'interno dal batterio, e i loro geni espressi, indipendentemente dal cromosoma principale. Essi vengono trasmessi alle cellule figlie nella divisione cellulare, conferendo lo stesso vantaggio a tutte le cellule figlie.

Funzioni dei plasmidi Tra le caratteristiche funzionali che i plasmidi sono in grado di conferire, figurano: ･ la produzione o la resistenza agli antibiotici, ai metalli pesanti e ai raggi UV; ･ l'utilizzo di fonti di carbonio insolite o la fissazione di azoto inorganico nel suolo; ･ la produzione di proteine in grado di uccidere gli altri batteri (batteriocine); ･ la virulenza (sono codificate a livello plasmidico x es.: la neurotossina di Clostridium botulinum; molte batteriocine; le adesine di patogeni intestinali).

DNA dei Plasmidi Tutte queste caratteristiche, unite alla conoscenza degli enzimi di restrizione in grado di tagliare il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche, hanno portato i biologi molecolari ad utilizzare i plasmidi per introdurre nei batteri del DNA a loro estraneo, al fine di produrre proteine oppure per amplificare tratti di DNA. Inserendo un gene per una proteina in un plasmide, ed immettendo il plasmide in un batterio, posso conferire a tutte le cellule figlie di quel batterio la capacità di sintetizzare la proteina, della quale posso quindi produrre quantità a piacere.

Gli enzimi Per «tagliare e incollare» il DNA si utilizzano particolari enzimi Infatti gli strumenti per ottenere DNA ricombinante sono: enzimi batterici chiamati enzimi di restrizione che riconoscono brevi sequenze di nucleotidi del DNA e le tagliano in punti precisi; l’enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei filamenti di DNA catalizzando la formazione di legami covalenti

Enzimi di restrizione Sono enzimi presenti nei procarioti che difendono il batterio dal DNA estraneo, ad es., da parte di fagi, tagliandolo in punti specifici e quindi riducendolo in frammenti più piccoli, non infettanti.

Enzimi di restrizione Gli enzimi riconoscono sequenze specifiche composte da 4 a 8 basi dette sito o sequenza di riconoscimento; Gli enzimi di restrizione possono effettuare due tipi di taglio: netto come l’enzima HpaI sfalsato come l’enzima EcoRI che taglia in maniera asimmetrica creando “estremità appiccicose”

Nomenclatura degli enzimi di restrizione Il nome dell’enzima di restrizione ci indica da quale organismo essi sono stati isolati. Ad esempio l’enzima EcoRI proviene dal ceppo di Escherichia coli . Regole: E = genere Escherichia (genere a cui appartiene l’organismo) Co = specie coli (seconda e terza lettera derivano dalle iniziali della specie) R = Ceppo RY13 I = prima endonucleasi isolata (numero romano indica l’ordine di isolamento delle varie endonucleasi dello stesso organismo)

Endonucleasi di tipo II Nelle tecnologie del DNA ricombinante vengono ampiamente utilizzate endonucleasi di tipo II, nelle quali la sequenza riconosciuta dall’enzima coincide con quella effettivamente tagliata. Le sequenze di classe II sono sequenze palindromiche del tipo: 5’.….GGTACC…..3’ 3’…..CCATGG…..5’ Il palindromo (dal greco πάλιν "indietro" e δρóμος "corsa", col significato "che corre all'indietro") è una sequenza di caratteri che, letta a rovescio, rimane identica.

TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE Il procedimento consta di 5 fasi successive: Isolamento del gene che codifica per la proteina che si vuole ottenere in gran quantità; Costruzione di una molecola di DNA RICOMBINANTE: il DNA da isolare ed un plasmide batterico vengono tagliati dallo stesso enzima di restrizione; queste due molecole tendono a formare legami ad idrogeno alle loro estremità che vengono unite dall’enzima DNA-ligasi (taglio e cucito), si ottiene così un DNA ricombinante; Introduzione del DNA ricombinante nella cellula ospite: il plasmide, pur contenendo DNA estraneo, si riproduce più volte duplicando così anche il DNA associato; Clonazione del DNA: i batteri così modificati si riproducono: le cellule sono tutte geneticamente identiche; questo insieme di cellule batteriche è detto CLONE. Poichè anche il DNA ricombinante, presente nella cellula originaria, si è riprodotto, si dice che il gene è stato CLONATO; Recupero della proteina mediante purificazione

TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE Nel clonaggio di un gene si opera sulle molecole con un «taglia e cuci».

TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE E.coli Plasmide DNA Gene V Estremità coesive Batterio ricombinante Cellula umana Plasmide con DNA ricombinante Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano

ALCUNI PRODOTTI OTTENUTI PER LA CURA DELLA SALUTE ormone della crescita insulina umana - TPA (attivatore tissutale del plasminogeno) Calcitonina ormone importante per la fissazione del calcio a livello osseo fattore VIII della coagulazione per il trattamento dell’emofilia vaccini contro malattie virali (per esempio epatite B interferoni (proteine attive contro i virus)

Applicazioni

Applicazioni

https://www.scribd.com/doc/73130546/PRO-E-CONTRO-Biotecnologie