Laboratorio n° 5: Sintomatologia Inoculo di Patogeni fogliari

Lo studio dei sintomi Sintomi: i sintomi possono essere localizzati (compaiono soltanto sui tessuti circostanti il punto di ingresso del patogeno) o sistemici (si manifestano in modo diffuso su diverse parti o su tutta la pianta, quindi lontano dal punto di ingresso del patogeno) Classificazione dei sintomi: - Modificazioni cromatiche - Modificazioni di forma e dimensione - Necrosi ed alterazioni degenerative

Necrosi ed altre degenerazioni Necrosi: sintomi derivante dalla morte di gruppi di cellule o estese zone di tessuto. Necrosi puntiformi: macchie necrotiche molto piccole. Cercospora beticola

Necrosi ed altre degenerazioni Picchiettatura: macchie necrotiche di piccole dimensioni, ma più grandi di quelle puntiformi (es. Pseudomonas syringae pv. tomato; Macchiettatura batterica del pomodoro) Rispetto ai funghi, le macchie fogliari dovuti ai batteri sono più irregolari e “angolari” in relazione alla morfologia della foglia, in quanto i batteri hanno maggiori difficoltà nel superare ostacoli fisici (venature). Spesso le macchie fogliari sono idropiche (water-soaking) a causa della distruzione enzimatica dei tessuti vegetali

Necrosi ed altre degenerazioni Maculature: macchie necrotiche di maggiori dimensioni Maculatura bruna del pero (Stemphylium vesicarium) Maculatura batterica del pomodoro (Xanthomonas vesicatoria)

Necrosi apicali e marginale: Interessano l’apice o il margine della foglia per poi estendersi al lembo. Necrosi ed altre degenerazioni Phytophthora ramorum Clavibacter michiganensis subsp.michaganensis

Antracnosi: macchie necrotiche con area interna leggermente depressa Necrosi ed altre degenerazioni Colletrotrichum lindemuthianum Marssonina juglandis

Vaiolatura o impallinatura: macchie necrotiche la cui area interna può distaccarsi. Necrosi ed altre degenerazioni

Suberosi: Sintesi ed accumulo di suberina in organici e tessuti che normalmente non ne accumulano.

Necrosi ed altre degenerazioni Marciumi: spesso i tessuti necrotici hanno un colore scuro (bruno-nerastro) e aspetto secco ed asciutto. Al contrario, nel caso dei marciumi il tessuto appare molliccio e deliquescente. In tal caso si parla di marciumi molli. I marciumi sono spesso determinati dalla degradazione della lamella mediana delle cellule del dovuta all’azione di enzimi litici rilasciati dai patogeni fungini e batterici. Marciumi molli da Erwinia spp.

Necrosi ed altre degenerazioni Marciumi secchi: In alcuni casi i marciumi il tessuto non appare molliccio e deliquescente, ma bensì secco e asciutto. In tal caso si parla di marciumi secchi e frutti mummificati.

Inoculo di patogeni fogliari

I postulati di Koch 1° 2° 3°

L’inoculo dei funghi fitopatogeni Numerosi funghi fitopatogeni producono spore (conidi derivanti da riproduzione asessuata) atte alla diffusione del fungo. Botrytis spp. Fusarium spp.

Le spore possono essere utilizzate a fini sperimentali per riprodurre l’inoculo di un determinato fungo in condizioni controllate e con un potenziale di inoculo noto. L’inoculo dei funghi fitopatogeni fogliari Oltre alle spore possono essere utilizzati per l’inoculo anche: - Micelio fungino - Tasselli di substrato agarizzato colonizzato dai funghi In tal caso però non è possibile quantificare con certezza il livello di inoculo che si utilizza.

Le spore possono essere applicate all’apparato fogliare sulla superficie intatta (senza ferita) o su ferite appositamente prodotte (con ferita) in quantità definita. L’inoculo dei funghi fitopatogeni fogliari Successivamente, il materiale inoculato può essere incubato in camera umida o con livelli di umidità ambientali.

Stato delle foglie di pomodoro dopo 60 ore dall’inoculo Controllo: 0% sansa Suolo ammendato con 1% sansa Suolo ammendato con 3% sansa Fig. 13 Sviluppo dell’infezione di Botrytis (tacche necrotiche) dopo 60 ore dall’inoculo sulle piante di controllo e sulle piante crescite su substrato arricchito con l’1% e il 3% di sansa. Il livello di infezione è risultato superiore nelle piante cresciute su sansa.

Quantificazione dell’inoculo L’inoculo con spore deve essere quantificato contando il numero di spore presenti nella soluzione da utilizzare Tale operazione si effettua attraverso il vetrino conta globuli o emacitometro o vetrino tipo Burker PROCEDURA: 1_In appositi quadrati si contano il numero di spore presenti (da effettuare in almeno 8-10 quadrati) 2_Il numero di spore nella soluzione (n° / ml) si ottiene moltiplicando la media dei quadrati X 250,000 3_Una volta calcolata la concentrazione di spore nella nostra soluzione si calcolano ed effettuano le diluizioni necessarie per ottenere la concentrazione di spore desiderata 4_Infine, la soluzione ottenuta viene applicata sulle foglie

Quantificazione e diluizione dell’inoculo Diluizioni dell’ inoculo con spore Concentrazione iniziale: CI (conidi ml -1 ) Concentrazione finale desiderata: CFD (conidi ml -1 ) Volume finale desiderato: VF (ml) Volume iniziale : VI (ml) CI : CFD = VI : VF VF = (VI x CFD) / CI = Esempio: CI = 2.3 * 10 7 ml -1 CFD = 1 * 10 6 ml -1 VI = 1 ml VF = ? VF = (1*10 6 x 1) / 2.3*10 7 = ml (44 µl) VF = 44 µl contengono spore VF = 44 µl µl = 1,000 µl VF = 1,000 µl alla concentrazione di 1 * 10 6 CI : VI = CFD : VF VF = (CDF * VI) / CI =

Attività di laboratorio

Selezione e preparazione dei campioni vegetali Lavaggio in acqua corrente per eliminare i residui grossolani Lavaggio con ipoclorito di sodio al 3% per eliminare altri microrganismi (sterilizzazione superficiale) Lavaggio con acqua sterile per eliminare l’ipoclorito Asciugare i campioni

Preparazione delle sospensioni di conidi Porre 10 ml di acqua sterile nelle piastre. Successivamente, frizionare la superficie con un’ansa (permette il distacco delle spore) Prelievo delle soluzioni e filtrazione con lana di vetro (trattiene il micelio ma permette il passaggio delle spore) (Falcon 15 ml) Conta delle spore e preparazione delle soluzioni da inoculare alla concentrazione desiderata: 1_Bassa concentrazione: 100,000 spore / ml ; 1 x 10 5 spore / ml 2_Alta concentrazione: 1,000,000 spore / ml; 1 x 10 6 spore / ml Porre 100 µl di inoculo sui campioni (2 gocce), successivamente lasciar asciugare. Inoculo da effettuare su campioni intatte e feriti (taglio di 5 mm effettuato con bisturi) Centrifugazione (5 minuti), rimozione del supernatante e aggiunta di acqua sterile (10 ml) ai tubi Falcon

Computo materiali: - campioni vegetali (frutti di agrumi e foglie di fagiolo) - sistemi pianta-patogeno: 1 - Agrumi + Penicillium italicum 2 – Acini uva + Botrytis cinerea - Bisturi - Piastre petri dei due miceti - Acqua sterile - Filtri lana di vetro sterili - Vetrino tipo Burker (camera conta globuli) - Tubi Falcon (15 ml) sterili Inoculo patogeni fogliari Calcolo per la diluizione della sospensione di spore: CI = 2.3 * 10 7 ml -1 CFD = 1 * 10 6 ml -1 VI = 1 ml VF = ? VF = (1*10 6 x 1) / 2.3*10 7 = ml (44 µl) VF = 44 µl contengono spore VF = 44 µl µl = 1,000 µl VF = 1,000 µl alla concentrazione di 1 * 10 6

Comunemente vengono utilizzate cellule vive dei patogeni. Questo richiede che la colonia di partenza sia “rinnovata” con frequenza. Rinnovo delle colonie batteriche: - rinnovo attraverso “scrisciamento” su substrato NA - tecnica finalizzata a “diluire” in piastra la popolazione batterica fino ad ottenere colonie singole Coltivazione e inoculo di batteri fitopatogeni