Spettroscopia UV-VIS Nella spettroscopia UV-VIS il campione è irraggiato con luce avente  nell’UV, nel visibile . Le molecole che compongono il campione assorbono l’energia irradiata se essa è in quantità sufficiente oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile) La risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole. Il tipo di interazione fornisce la risposta analitica: qualitativa  identificazione attraverso le  assorbite quantitativa  calibrazione con soluzioni a concentrazione nota, legge di Lambert-Beer (A = bC)

I livelli energetici delle molecole sono quantizzati, pertanto solo i fotoni aventi energia pari a quella di separazione tra due livelli vengono assorbite. A differenza degli atomi, nelle molecole vi sono livelli energetici vibrazionali e rotazionali che si aggiungono ai livelli elettronici. IR microonde UV-Vis-NIR

 nella spettroscopia molecolare gli spettri sono a bande (dx) aventi l massime caratteristiche, in quanto le transizioni avvengono contemporaneamente a livelli diversi di energia (elettronica, vibrazionale o rotazionale)

Energia delle radiazioni Nella tecnica UV-vis-NIR si impiegano radiazioni nell’intervallo 200-1100 nm, la cui energia è sufficiente ad attivare transizioni elettroniche, che causano il passaggio di elettroni degli strati esterni a stati eccitati UV (Ultravioletto)  200-400 nm (lontano UV) Visibile  400-800 nm NIR (Near Infrared)  800-1100 nm (vicino IR) Energia

Elettroni n e p Gli elettroni coinvolti nelle transizioni possono essere di tipo p (legami multipli) oppure n (non legame); gli elettroni di tipo s (legami semplici) hanno energie superiori all’UV

Transizioni elettroniche Le transizioni elettroniche più comuni sono illustrare nella figura sottostante. Esse si verificano se nel campione sono presenti molecole aventi cromofori, cioè gruppi funzionali in grado di assorbire la luce, come il gruppo –NO2 (nitro), -N2- (azo) Solo le transizioni di elettroni n e  hanno energie nel range 200-800 nm, quindi rivelabili con l’UV-visibile

Spettrofotometro a singolo raggio Spettrofotometro a doppio raggio

Gruppi cromofori Alcuni esempi di gruppi cromofori con i relativi coefficienti di estinzione molare o assorbività molare () Cromoforo Esempio Transizione max, nm  Solvente C=C Etene   * 171 15,000 esano CC 1-Esino 180 10,000 C=O Etanale n  *   * 290 180 15 10,000 N=O Nitrometano 275 200 17 5,000 etanolo C-X   X=Br       X=I Metil bromuro o ioduro n  * n  * 205 255 200 360

Le transizioni elettroniche promosse dalla radiazione UV-vis coinvolgono anche i vari livelli vibrazionali. Per questo motivo lo spettro è del tipo “a bande”. Questa caratteristica complica notevolmente il riconoscimento e la quantificazione di composti in miscela Esempio di spettro UV-visibile di un’aldeide insatura. La banda a 395 nm rende conto del fatto che il composto è colorato in arancio, colore complementare rispetto al violetto che corrisponde alla regione spettrale interessata (~ 400 nm) Le bande di assorbimento in UV-vis-NIR sono in numero minore rispetto all’IR, tuttavia è possibile utilizzarle per effettuare determinazioni quantitative secondo la legge di Lambert-Beer

Spettri di assorbimento di varie forme dell’EMOGLOBINA Assorbanza Lunghezza d’onda (nm)

APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA Analisi quantitatitiva: Misura della concentrazione di molecole che assorbono la luce come le proteine e gli acidi nucleici Misura della concentrazione di molecole che non assorbono la luce, dopo derivatizzazione con un cromoforo o conversione chimica in un composto che assorbe la luce Studio delle interazioni delle macromolecole (DNA o proteine) con ligandi o altre macromolecole Studio delle cinetiche di reazione (cinetica enzimatica) Analisi qualitativa: identificazione di classi di composti, sia in forma pura che in preparati biologici. Identificazione di intermedi di reazione.

P + L  P•L Esempio di studio delle interazioni PUNTI ISOSBESTICI Esempio di studio delle interazioni tra una macromolecola (P) ed un ligando (L) Esempio di studio di una cinetica di reazione CH3-CH2-OH CH3-CHO NAD NADH

Applicazioni generali dell’UV-vis misure di concentrazione a  singola (A = bC) misure  singola per seguire reazioni spettri di assorbimento in intervalli di  per identificare gruppi cromofori e molecole rivelazione in sistemi cromatografici: eluente  Io eluente + analita  I pompa HPLC colonna di separazione rivelatore a doppio raggio cromatogramma

Gli spettrofotometri UV-vis-NIR sono estremamente diffusi per la loro semplicità di utilizzo e versatilità e per il basso costo. La maggior parte degli strumenti hanno range strumentale limitato all’UV-visibile (180-800 nm), dove comunque quasi tutte le sostanze organiche presentano assorbimenti. Strumenti più sofisticati arrivano fino al NIR. Un utilizzo molto comune si ha come rivelatore per cromatografia

Analisi quantitativa (spettrofotometria) in luce trasmessa Legge di Beer: Abs = bC  = assorbività molare (o coefficiente di estinzione molare): dipende dall'analita e dalla lunghezza d'onda b = lunghezza del percorso del raggio nel campione C = concentrazione molare della specie assorbente L'assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione: Abs = KC La quantificazione è accurata solo se, alla lunghezza d’onda di analisi, l’analita è l’unica specie assorbente