VETTORI NON VIRALI

VETTORI Vettori: veicolo per l’introduzione e l’espressione di un gene

Adenovirus Retrovirus Virus adeno-associati Lentivirus (derivati da HIV) Herpesvirus Plasmidi nudi Elettroporazione in vivo Liposomi Amine, proteine cariche positivamente VETTORI PER TERAPIA GENICA Vettori virali: Vettori non virali:

VETTORE IDEALE Tropismo di espressione: per garantire la localizzazione del transgene sia a livello trasduzionale (il vettore infetta cellule specifiche), che a livello trascrizionale (il gene viene espresso solo in alcune cellule). Durata di espressione: per far sì che la terapia duri nel tempo. Livello di espressione: possibilmente regolabile. Efficacia clinica: test funzionali su modelli animali. Scarsa tossicità.

Durata della Trasduzione Stabile o Transiente Espressioni stabili sono preferibili per malattie metaboliche Espressioni transienti sono preferibili per vaccini e tumori

Fasi fondamentali per il trasferimento genico in sistemi non virali ● Impacchettamento del DNA ●Ingresso nelle cellule ●Trasporto nel nucleo ●Espressione del gene

Barriere Cellulari ed Extracellulari membrane citoplasmatiche e nucleari, lisosomi, endonucleasi. barriera ematoencefalica, il sistema immunitario e fluidi corporei

Promotori forti virali (CMV) Bassi livelli di transgene, somministrazione locale Durata di espressione limitata Tossicità molto bassa Efficacia clinica solo quando sono necessarie basse quantità di transgene o immunizzazione E’ facilmente degradate dalle nucleasi dell’ospite: bassa efficienza VETTORI NON VIRALI Plasmidi nudi

METODI NON VIRALI Metodi fisici Metodi biochimici Metodi chimici

Formazione di pori di membrana

Plasmidi con cassette di espressione Campo elettrico permealizza le cellule Somministrazione locale Livelli di transgene più alti Durata di espressione prolungata Tossicità molto bassa (scarica elettrica) Efficacia clinica solo quando sono necessarie basse quantità di transgene o immunizzazione Elettroporazione in vivo

Parametri: ●Intensità di voltaggio ● Pulsazione\s (ampiezza, numero, frequenza) ● Configurazione dell’elettrodo ● Sito di rilascio Tutti i parametri vanno valutati per ogni applicazione Elettroporazione in vivo

ELETTROPORAZIONE IN VIVO Strumentazione e Applicazioni A e B: strumenti per elettroporazione C: elettroporazione in pelle D: elettroporazione in muscolo

MICRONEEDLES Fabbricazione con sistemi di microelettrochimica Valida alternativa alla somministrazione orale e parenterale Superamento della barriera dello strato corneo (limite per molti farmaci) Delivery nell’epidermide senza distruzione delle terminazioni nervose

Lenght  m Diameter 300  m

Poke and patch Coat and poke

Poke and release Poke and flow

VANTAGGI Somministrazione di grandi molecole Somministrazione senza dolore Rapida guarigione nel sito di iniezione Semplicità di somministrazione Minore possibilità di infezione nel sito di iniezione Rapido rilascio in associazione con altri sistemi fisici

SVANTAGGI Manualità di iniezione Variabilità dello spessore e della idratazione dello strato corneo che porta ad una variabilità di penetrazione del farmaco Iniezioni ripetitive possono collassare le vene

VETTORI NON VIRALI Lipidi cationici Dominio idrofobico Spacer Dominio cationico

LIPIDI CATIONICI E NEUTRI

VETTORI POLIMERICI

SNALP

Vantaggi dei liposomi cationici ●Presentano un elevato profilo di sicurezza rispetto ai vettori virali ●Possono contenere DNA di grandi dimensioni ●La trasfezione non richiede la divisione cellulare

Limiti dei liposomi cationici Il principale limite dei sitemi liposomiali consiste nella scarsa selettività

Lipidi cationici associati a DNA

Poliamine Ligando Spacer Dominio cationico

Poliamine associate a DNA

● Metodo di trasfezione che utilizza il pathway fisiologico per l’endocitosi recettore transferrina (Tf)-mediato. ● Tf è legato chimicamente a policationi che condensano il DNA. ● Polylysine (Tf-pLys) e polyethylenimine (Tf- PEI). Transferrinfection

Policationi peptidici Vantaggi: Riconoscimento specifico della cellula Svantaggi: Limite dovuto al tipo di impacchettamento del DNA che ne influenza la traslocazione in membrana

Tossicità minima o assente Facili da produrre Buona trasduzione di alcuni tipi cellulari Non ci sono limiti alla grandezza del transgene Utili per terapia locale VETTORI NON VIRALI Vantaggi

Livelli bassi di espressione Espressione transiente VETTORI NON VIRALI Svantaggi