Diagnostica molecolare Clinica

Tecniche di biologia molecolare medicina di laboratorio clinica medicina di laboratorio La diagnostica molecolare combina la medicina di laboratorio con le nuove conoscenze e tecnologie della genetica molecolare ed è stata enormemente rivoluzionata negli ultimi anni, beneficiando delle scoperte nel campo della biologia molecolare. Infatti, l’identificazione e la fine caratterizzazione delle basi genetiche delle malattie è di importanza fondamentale per porre accuratamente una diagnosi. La diagnostica molecolare al momento è una realtà clinica che pone le sue basi nella ricerca di base (espressione genica e loro funzionalità) Ricerca di base

Diagnostica Molecolare Prevenzione Diagnostica Molecolare Diagnosi Qual’è ad oggi lo scopo della diagnostica molecolare clinica? Dove si colloca? Terapia a a a a a a

RUOLO E FINALITA’ DELLA DIAGNOSTICA MOLECOLARE La Diagnostica molecolare clinica può essere considerata come l’integrazione della medicina di laboratorio tradizionale, una sua naturale evoluzione in senso specialistico. Essa infatti rappresenta l’insieme delle tecniche atte a determinare la natura e la sede di una malattia sulla base dei sintomi (diagnostica clinica). La differenza rispetto alla medicina di laboratorio è che essa va ad analizzare specifici segnali molecolari che la malattia fa emergere.

RUOLO E FINALITA’ DELLA DIAGNOSTICA MOLECOLARE La diagnostica molecolare clinica, consente quindi in maniera più estesa di identificare e quantificare, i marcatori, ovvero le molecole segnale di svariata natura chimica,presenti nei fluidi extracellulari, nelle cellule o nei tessuti che determinano un’alterazione patologica di un organo. Tali marcatori possono essere di origine esogena ed endogena

Comprendono parti (materiale genetico) o specifici prodotti MARCATORI ESOGENI Comprendono parti (materiale genetico) o specifici prodotti (es. tossine) di agenti infettivi patogeni per l’uomo. Agenti chimici presenti nell’ambiente che penetrano nell’organismo umano: -sostanze presenti in natura (pollini) -agenti xenobiotici Agenti xenobiotici che derivano cioè da processi di inquinamento ambientale la cui identificazione è spesso resa difficoltosa dal fatto che una volta entrati nell’organismo subiscono dei processi di biotrasformazione per cui la loro struttura chimica può differire anche in maniera considerevole rispetto a quella originaria

MARCATORI ENDOGENI MARCATORI DI FUNZIONE MARCATORI DI LESIONE

MARCATORI DI FUNZIONE Comprendono tutte quelle sostanze presenti a vario titolo nei tessuti e/o nei fluidi extracellulari: Metaboliti (enzimi, ormoni, citochine immunoglobuline). Sono di solito presenti in quantità minime, per aumentare in seguito a stimoli fisiologici (es. ormoni) o patologici (citochine, Immunoglobuline). L’interpretazione dei dati forniti da questi marcatori può essere di notevole utilità nell’individuare la carenza ad esempio di specifici enzimi.

MARCATORI DI LESIONE Sono sostanze che fanno parte della normale struttura delle cellule di un tessuto od organo che in seguito ad un evento lesivo, vengono rilasciati nei fluidi extracellulari Essi forniscono quindi un’informazione immediata sulla struttura biologica danneggiata, con specificità a livello cellulare e/o molecolare

MARCATORI DI LESIONE :esempio La presenza della lattico deidrogenasi nel plasma sta ad indicare un danno cellulare, poichè questo enzima è normalmente intracellulare; L’analisi delle sue isoforme consentirà di stabilire se esso deriva ad es. dal miocardio (LDH1 e LDH2) o dal fegato (LDH5). Talvolta tali marcatori possono dare informazioni sulla gravità e sull’estensione del danno.

Non sempre la distinzione tra marcatori di funzione e di lesione è sempre cosi netta: Esempio: I marcatori tumorali sono di solito sostanze esistenti nei tessuti e/o nei liquidi extracellulari quale espressione della presenza nell’organismo di una malattia neoplastica in atto (metaboliti, ormoni, proteine prodotti di oncogeni). Quindi non tutti i segnali biochimici o fisiopatologici lanciati da una semplice alterazione funzionale o da un processo patologico in atto rispondono ai requisiti di un marcatore molecolare. In altri termini una determinata sostanza, per essere utilizzata come indicatore deve possedere alcuni requisiti essenziali

MARCATORE IDEALE (I) Essere presente nel campione biologico in quantità idonee per poter essere rilevata con le tecniche di laboratorio disponibili Essere dosabile con metodiche tecnicamente valide e atte a conferire caratteristiche di sensibilità, specificità e affidabilità (precisione, accuratezza). Essere dotato di un’adeguata sensibilità e specificità diagnostica ovvero essere assente nei soggetti sani o, se presente anche nei soggetti sani, raggiungere livelli significativamente superiori rispetto a quelli normali (idoneo “cut off”). Essere rilevabile precocemente (idonea “finestra diagnostica”) in modo da fornire indicazioni affidabili già in una fase preclinica della malattia.

MARCATORE IDEALE (II) Essere correlato con la gravità della malattia Essere sensibile all’efficacia dei trattamenti in modo da poter essere utilizzato nel corso del monitoraggio della terapia. Essere basato su procedure minimamente invasive, ben accette dal paziente, veloci, ed esibire un rapporto ottimale costo/benefici.

MARCATORE IDEALE (III) Molti marcatori attualmente in uso forniscono una buona affidabilità analitica e predittività tali da consentirne un adeguato uso clinico Le tecniche di diagnostica molecolare possiedono livelli di sensibilità e specificità superiori ai metodi convenzionali. Disponibilità di ambienti ed attrezzature adeguate, operatori con elevato livello di competenza ed aggiornamento Non bisogna dimenticare però che l’iter diagnostico per inquadrare una malattia è sempre prima rappresentato dall’anamnesi, dall’esame obiettivo e va definito caso per caso Affidabilità analitica: un metodo che sia al contempo accurato, preciso, sensibile selettivo Per Predittività o valore predittivo positivo si intende la probabilità che un soggetto positivo ad un test di screening sia effettivamente malato

Applicazioni della Diagnostica Molecolare Clinica Malattie genetiche ereditarie Diagnostica prenatale Malattie genetiche acquisite Screening e monitoraggio di malattie oncologiche Individualità biologica Valutazione della predisposizione genetica Diagnosi molecolare delle infezioni batteriche e virali Malattie gen ereditarie: malattie quindi trasmesse dai genitori a tutta o ad una parte della prole Talassemia , emofilia, fibrosi cistica, Diagnostica prenatale:alcune malattie genetiche sono predestinate a manifestarsi fin dal concepimento e quindi una delle applicazioni della diagnostica molecolare clinica è rappresentata dalla diagnostica prenatale attraverso il prelievo dei villi coriali o degli amniociti Malattie genetiche acquisite: tumori, leucemie Individualità biologica ovvero (o fingerprint, o fingerprinting genetico) il profilo derivato dalla applicazione di determinati marcatori molecolari ad un genoma, al fine di renderlo riconoscibile e rintracciabile e per definire il grado di imparentamento tra gruppi di organismi. L'impronta genetica è utilizzata in medicina legale per provare la corrispondenza tra persone sospette e DNA proveniente da campioni di sangue, capelli, saliva, sperma, ecc. È usata anche nell'identificazione di resti umani, nei test di paternità, nella determinazione della compatibilità per il trapianto di organi. Valutazione della predisposizione genetica ovvero lo studio delle diverse risposte dei soggetti ai farmaci Diagnosi molecolare delle infezioni batteriche e virali: utilizzo delle metodiche di biologia molecolare per la dx di tubercolosi, toxoplasma, tripanosoma, epatite b, c, HIV etc.

........qualche cenno di genetica

Garrod: Pioniere nella ricerca degli errori congeniti del metabolismo, scoprì l'alcaptonuria, malattia che rende le urine nerastre, evidenziando la sua ereditarietà. Beadle e Tatum attraverso une serie di esperimenti effettuati sui funghi dimostrarono che i geni controllano le reazioni biochimiche

GENI-AMBIENTE-CARATTERI GENOTIPO insieme dei geni di un organismo FENOTIPO insieme dei caratteri di un organismo Genotipo Ambiente A B I II Fenotipo 1 Fenotipo 2 Fenotipo 3 Fenotipo 4 Fenotipo 5 Fenotipo 6 Fenotipo 7 Fenotipo 8 Fenotipo 9 Fenotipo 10 Perturbazioni casuali dello sviluppo Norma di reazione di A agli ambienti I e II Norma di reazione di B agli ambienti I e II Il fenotipo è l’insieme di tutti i caratteri biochimici, fisiologici, anatomici , eventualmente comportamentali di un individuo che si possono mettere in evidenza a livello di molecole,di cellule, di tessuti, di organi, di organismi e talvolta di popolazioni. Il genotipo è l’insieme dei geni di un individuo, cioè dei fattori che ne determinano l’ereditarietà dei caratteri. Lo sviluppo delle caratteristiche di un organismo dipende dalle interazione del suo genotipo con un particolare ambiente. Lo stesso genotipo può produrre fenotipi diversi a seconda delle condizioni favorevoli o sfavorevoli dell’ambiente in cui avviene lo sviluppo. La risposta che il genotipo da ai condizionamenti ambientali è detto norma di reazione. Infine l’interazione di un particolare genotipo con un particolare ambiente può dare luogo a più fenotipi possibili, in seguito a perturbazioni casuali dello sviluppo. Spesso i termini genotipo e fenotipo non sono riferiti all'insieme rispettivamente dei geni e dei caratteri, ma solo ad uno di o a pochi di essi che sono oggetto di indagine.

Tutte le indagini di diagnostica molecolare si basano sull’analisi effettuate sul DNA contenuto nel patrimonio genetico di ciascun individuo Tutte le indagini di diagnostica molecolare si basano sull’analisi effettuate sul DNA contenuto nel patrimonio genetico di ciscun individuo

Il Dogma Centrale della Biologia

TRASCRIZIONE DEL DNA, TRADUZIONE DELL’RNA

Il patrimonio genetico Il patrimonio genetico (genoma) di un individuo è: costituito da DNA organizzato in geni ordinato in cromosomi Nell'uomo il genoma è costituito da 46 cromosomi (22 coppie di autosomi e due cromosomi sessuali, definiti XY nel maschio, e XX nella femmina). L’informazione genetica di tutti gli organismi viventi è contenuta nella sequenza di purine e pirimidine degli acidi nucleici. Nella maggioranza degli organismi l’informazione genetica è contenuta nel DNA. In certi virus l’inf. Gen. È contenuta nell’RNA. Il genoma rappresenta il patrimonio genetico degli a. nucleici.

Il patrimonio genetico I geni: fattori che determinano l’ereditarietà di un particolare carattere 2 esemplari dello stesso gene (alleli) Gli alleli uno paterno uno materno Il DNA è organizzato in "geni": fattore ereditario legato ad una particolare caratteristica semplice (carattere). Più geni possono concorrere diversamente nel determinare un carattere; per ogni gene ci sono due diversi esemplari, definiti"alleli" uno paterno ed uno materno.

Il patrimonio genetico Un individuo portatore di due alleli diversi (Aa) nello stesso sito cromosomico (locus) eterozigote per quel locus Un individuo portatore di due alleli identici (AA o aa) nello stesso sito cromosomico (locus) omozigote per quel locus Un individuo i cui due alleli per la determinazione di un carattere sono uguali si dice "omozigote (AA-aa)", se diversi tra loro si dice "eterozigote (Aa)".

Le Malattie genetiche Le cellule dell'organismo sono: Derivano da mutazioni del patrimonio genetico delle cellule dell’organismo Le cellule dell'organismo sono: Germinali Somatiche Le cellule somatiche costituiscono il corpo o soma di un organismo e formano i vari tessuti che, in organismi complessi, vanno a costituire organi e a loro volta apparati. Le cellule somatiche si distinguono dalle cellule germinali, come ad esempio i gameti, che costituiscono invece la linea germinale. Nell'uomo e in generale nei mammiferi le cellule della linea germinale sono gli spermatozoi e le cellule uovo (detti anche gameti). Si dice cellula somatica ogni cellula che non sia un gamete, un gametocita (la cellula da cui deriva il gamete) o una indifferenziata cellula staminale.

Mutazioni nelle cellule germinali trasmissione alla prole  malattie ereditarie Mutazioni nelle cellule somatiche la malattia non viene trasmessa alla prole Alterazioni in cellule somatiche sono presenti nei tumori Vediamo adesso quali sono le principali mutazioni causative per le malattie genetiche

Classificazione delle malattie genetiche Monogeniche o Mendeliane dovute all’alterazione di un singolo gene causate da alterazioni del numero o della struttura dei cromosomi Cromosomiche Multifattoriali dovute all'interazione fra geni diversi ed ambiente

Modalità di trasmissione delle malattie mendeliane Sono autosomiche se trasmesse dai cromosomi autosomici (dal cromosoma 1 al cromosoma 22) X-linked (legate al cromosoma X) se trasmesse dal cromosoma X Mutazioni dominanti: condizioni in un individuo eterozigote, in cui l’allele mutato si esprime fenotipicamente. si parla di dominanza di un allele su di un altro quando, in un individuo eterozigote, solo l'allele dominante si esprime, ossia influenza il fenotipo si parla di recessività relativamente ad un allele quando, in un individuo eterozigote, il carattere indotto dall'allele in questione non si manifesta fenotipicamente Mutazioni recessive: condizioni in un individuo eterozigote in cui l’allele mutato non si manifesta fenotipicamente. Le mutazioni recessive devono coinvolgere i due alleli per manifestarsi clinicamente

Le anomalie cromosomiche vengono evidenziate mediante Malattie cromosomiche Causate da anomalie cromosomiche che possono essere numeriche strutturali Le più frequenti anomalie numeriche sono le trisomie e le monosomie es. sindrome di Down  trisomia del cromosoma 21 Le anomalie cromosomiche vengono evidenziate mediante ANALISI DEL CARIOTIPO

Cariotipo o mappa cromosomica Cariotipo di una donna La mappa cromosomica si esegue mediante un semplice prelievo di sangue

Malattie multifattoriali   Malattie multifattoriali Sono determinate dall’interazione tra fattori genetici e fattori ambientali Sono trasmesse secondo modalità diverse da quelle mendeliane classiche ( fattori predisponenti all’insorgenza della malattia) Si manifestano con notevole variabilità nelle popolazioni Es. Diabete mellito, malattia celiaca ..etc Una malattia multifattoriale è una malattia che dipende da fattori ambientali e geni mutati. il risultato del carattere multifattoriale dipende dall’intervento di più geni e di fattori ambientali. La multiffatorialità dipende dalla suscettibilità o predisposizione genetica in determinate condizioni ambientali permissive e dala rdiotta penetranza dei geni predisponenti coinvolti cioè dalla ridotta relazione genotipo- fenotipo.

Da che cosa sono causate le mutazioni? Un certo numero di errori durante la replicazione del DNA avviene spontaneamente. Agenti fisici (ad es raggi X o UV) Agenti mutageni chimici Il tasso di mutazione può essere enormemente aumentato dall’esposizione ad agenti mutageni I mutageni chimici sono molecole che si combinano con il DNA oppure causano cambiamenti chimici nelle basi nucleotidiche oppure sono simili alle basi nucleotidiche e vengono incorporate al loro posto causando però errori di appaiamento

I diversi tipi di mutazioni Mutazioni geniche (o puntiformi) Mutazioni nel numero dei cromosomi Mutazioni nella struttura Mutazioni cromosomiche:

Mutazioni geniche Sostituzione Delezione Inserzione Le mutazioni geniche o puntiformi sono dovute in gran parte alla sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA con un’altra Altri tipi di mutazione si originano in seguito alla perdita (delezione) o alla inserzione di una base nel filamento del DNA Sostituzione Delezione Inserzione

Sostituzione di una base nucleotidica con un’altra La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene). In base alle conseguenze se ne distinguono tre tipi mutazioni silenti mutazioni di senso mutazioni non senso

Mutazioni silenti. Se in seguito alla sostituzione di una base si ottiene una tripletta che specifica per lo stesso aminoacido la proteina prodotta sarà la stessa Le sostituzioni silenti riguardano la terza base del codone, quella che varia tra codoni diversi che specificano lo stesso aminoacido

Mutazioni di senso. Nella maggior parte dei casi la nuova tripletta codifica per un diverso aminoacido CCU GCU Prolina Alanina La proteina avrà quindi lo stesso numero di aminoacidi ma una sequenza che differisce per un aminoacido

La gravità degli effetti di una sostituzione dipenderà dalla somiglianza tra l’aminoacido sostituito e il nuovo e dalla posizione della sostituzione Esempio 1 La sequenza dell’emoglobina dell’uomo, del maiale, del cane o del cavallo differisce per parecchi aminoacidi e pur tuttavia tutte queste emoglobine svolgono la funzione in modo efficiente. Alcune regioni della proteina sono molto simili (ben conservate) anche tra specie filogeneticamente lontane (ad esempio nell’emogolobina la regione dell’eme). Esempio 2 D’altra parte una singola sostituzione (la valina al posto di glutammato in posizione 6) che si ha nell’anemia falciforme porta alla completa non funzionalità e alla morte del soggetto

Mutazioni nonsenso. Se il nuovo codone che si forma dalla sostituzione codifica per il segnale di stop avremo una proteina più corta della precedente AAG UAG Lisina Codone di stop

Delezione o inserzione di una base (mutazioni per spostamento della griglia di lettura) Talvolta l’errore consiste nell’inserire una base in più nella sequenza del DNA. Altre volte durante la replicazione o durante la riparazione del DNA si ha la perdita di una base In entrambi i casi la lettura di tutta la sequenza che segue viene completamente alterata A (inserzione) A U G A G G A C U C C C G G A U U A Met Arg Thr Pro Gly Leu Asp Ser Arg Iso A U G A G G A A C U C C C G G A U U A

Meccanismi patogenetici delle mutazioni Alterazione strutturale di una proteina con formazione di un prodotto anomalo. - Carenza del prodotto normale; - Prodotto alterato che interferisce con quello normale; - Prodotto alterato con funzione diversa. Quali sono a questo punto i meccanismi patogenetici delle mutazioni? Alterazione quantitativa (riduzione o abolizione di una proteina WT), per mutazioni che riguardano sequenze di regolazione dell’espressione genica

Mutazioni nella struttura dei cromosomi Esistono 4 tipi principali di mutazione della struttura dei cromosomi delezione duplicazione inversione traslocazione

Delezione. Parte del cromosoma (e quindi delle basi del DNA) viene perduta. Tutti i geni contenuti nella parte interessata dalla delezione vanno perduti e quindi non possono esprimersi nel fenotipo a b c d e f g h i l m n o p q r s t u v z a b c d e f g h i l m n o p q r s v z t u 1) 2) Duplicazione. Parte del cromosoma viene duplicata. I geni contenuti nella parte interessata sono duplicati. Perciò la cellula contiene tre o quattro copie di ciascun gene. In qualche caso ciò può danneggiare la cellula in quanto i sistemi di regolazione possono essere alterati. Causa difficoltà nell’appaiamento degli omologhi a b c d e f g h i l m n o p q r s t u v z a b c d e f g e f g h i l m n o p q r s t u v z 1) 2)

Inversione. In seguito ad una rottura, una parte del cromosoma viene riunita in posizione invertita. A parte i geni che si possono trovare nel punto di rottura, non ci sono gravi conseguenze per la cellula. Tuttavia non può avvenire crossing over in questa regione in quanto essa non si appaia con quella del cromosoma omologo a b c d e f g h i l m n o p q r s t u v z a b c d e f g h i l m n o s t u v z a b c d e f g h i l m n o r q p s t u v z p q r 1) 2) 3)

Traslocazione. a b c d e f g h i l m n o p q r s t u v z Mutazione cromosomica che modifica la posizione di un segmento cromosomico e delle sequenze geniche in esso contenute. In seguito ad una rottura, una parte del cromosoma (es n° 6) si stacca e viene inserito in un cromosoma diverso (es n° 12). a b c d e f g h i l m n o p q r s t u v z A B C D E F G H I L M N O P Q R S T U V Z a b c d e f g h i l m n o p q r s t u v z 1) 2)

La traslocazione può essere: Semplice: trasporto di un segmento terminale a un cromosoma non omologo Reciproca: due break point in due cromosomi con scambio di materiale Bilanciata: senza perdita di materiale genetico (funzionante)

Variazioni nel numero dei cromosomi aneuploidia:perdita o aggiunta di 1 o più cromosomi rispetto all’assetto cromosomico normale Nullisomia: perdita di una coppia di cromosomi omologhi monosomia: perdita di un singolo cromosoma trisomia: aggiunta di un cromosoma ad una coppia di omologhi: es. trisomia 21 sindrome di Down tetrasomia: aggiunta di una coppia di cromosomi al normale assetto Aneuploidia: si intende la perdita o l’aggiunta di uno o più cromosomi rispetto all’assetto cromosomico normale

Dal campione biologico al referto Prelievo Richiesta Accettazione Indagini di laboratorio (estrazione degli a.nucleici,PCR ,etc.) Interpretazione del risultato Refertazione eventuale consulenza genetica Fase Pre-analitica Fase Analitica Per fase di accettazione intendiamo tutte quelle operazioni tecniche necessarie ad estrapolare dal campione biologico (sangue, tessuto , liquido amniotico, saliva) il tipo cellulare di interesse su cui effettuare l’indagine molecolare Fase Post-analitica

Percorso unidirezionale dell’iter diagnostico Fase analitica (estraz DNA, RNA,PCR, etc.) Fase Post-analitica (controllo di qualità, interpretazione del risultato) Fase preanalitica (prelievo, richiesta , accettazione) Refertazione

del campione biologico Accettazione del campione biologico L’accettazione rappresenta l’insieme di procedure da adottare per ottenere dal paziente un campione di materiale rappresentativo da utilizzare per effettuare successivamente l’analisi vera e propria.

È importante verificare…. l’idoneità del campione la corretta compilazione della richiesta la corrispondenza campione-richiesta

Richiesta:Notizie relative al paziente Nome, cognome, provenienza, età, sesso Sospetto diagnostico ed altre notizie cliniche Data del prelievo Data di arrivo del campione nel laboratorio Tipo di campione Eventuale fase della malattia Albero genealogico (in caso di malattie genetiche a trasmissione ereditaria)

Il modulo di richiesta deve essere riposto in una tasca separata della busta che contiene il materiale biologico SACCHETTI DOPPI PER TRASPORTO di PROVETTE Sacchetti realizzati in due parti, la prima con chiusura a “clip” per contenere le provette, la seconda a tasca aperta per contenere le richieste di esame. In caso di apertura accidentale della provetta o del contenitore non si hanno perdite di liquidi biologici (garantendo in tal modo la sicurezza dell’operatore) ed al tempo stesso si preserva la richiesta d’esame inserita nell’apposita tasca.

Al momento dell’accettazione del campione biologico in laboratorio è importante: verificare se sono state rispettate tutte le misure previste nelle manipolazioni preanalitiche

Campioni biologici Modalità di prelievo Sangue periferico Prelievo venoso Sangue midollare Puntura lombare Villi coriali Villocentesi Amniociti Amniocentesi Cellule da tessuto Biopsia Ossa e denti Bulbi capilliferi …

Diagnostica molecolare CAMPIONI BIOLOGICI Biochimica classica Diagnostica molecolare