Caratteristiche di un ceppo industriale: geneticamente stabile puro, non contaminato produttivo dovrebbe produrre solo il prodotto desiderato e non altri sottoprodotti facilmente conservabile suscettibile di miglioramento La coltura microbica (ceppo) usata nel bioprocesso brevettato costituisce parte integrante ed essenziale del procedimento ed è, quindi, protetta dal brevetto (1949, U.S.A.)

Miglioramento dei ceppi Insieme delle tecniche che permettono di ottenere e selezionare (micro)organismi opportunamente modificati per le fermentazioni industriali (strain development) Negli organismi viventi catabolismo e anabolismo sono finemente regolati Un approccio razionale al miglioramento richiede la conoscenza delle vie metaboliche, degli enzimi coinvolti dei meccanismi di regolazione Le tecniche impiegate: 1.Mutagenesi e selezione 2.Ricombinazione 3.Ingegneria genetica 4. Ingegneria metabolica e systems biotechnology

Ricerca nel suolo di ceppi produttori di antibiotici

A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance Antibiotic resistance is spreading faster than the introduction of new compounds into clinical practice, causing a public health crisis. Most antibiotics were produced by screening soil microorganisms, but this limited resource of cultivable bacteria was overmined by the 1960s. Synthetic approaches to produce antibiotics have been unable to replace this platform. Uncultured bacteria make up approximately 99% of all species in external environments, and are an untapped source of new antibiotics. We developed several methods to grow uncultured organisms by cultivation in situ or by using specific growth factors. Here we report a new antibiotic that we term teixobactin, discovered in a screen of uncultured bacteria. Teixobactin inhibits cell wall synthesis by binding to a highly conserved motif of lipid II (precursor of peptidoglycan) and lipid III (precursor of cell wall teichoic acid). We did not obtain any mutants of Staphylococcus aureus or Mycobacterium tuberculosis resistant to teixobactin. The properties of this compound suggest a path towards developing antibiotics that are likely to avoid development of resistance. Nature, 22 January 2015

1. Mutagenesi

La mutazione è un’alterazione stabile dell’informazione genetica contenuta nel DNA -è un’alterazione del genotipo, che non sempre si traduce in un’alterazione del fenotipo -è un evento casuale: la frequenza di mutazione spontanea è di per cellula per generazione -è indotta da agenti mutageni, l’azione mutagena aumenta la frequenza di mutazione

Distribuzione della produttività dell’ antibiotico tetraclorociclina nell’ambito di un insieme di varianti naturali di Streptomyces viridifaciens Distribuzione della produttività dell’ antibiotico tetraclorociclina nell’ambito di un insieme di sopravvissuti di Streptomyces viridifaciens al trattamento mutageno UV. Mutagenesi con UV

Selezione dei mutanti Se il trattamento mutageno ha fatto aumentare la frequenza di mutazione fino a 10 -4, occorre effettuare una selezione (screening) su almeno 10 4 cloni per trovarne uno mutato. Come si effettua la selezione dei mutanti? Attraverso l’isolamento dei mutanti con diversi metodi. metodi diretti:valutando la capacità di produzione dei cloni sopravvissuti al trattamento metodi indiretti: utilizzando un metodo in grado di selezionare i mutanti dal selvatico (wild type) in base a caratteristiche diverse dalla produzione ma ad essa correlate Diversi tipi di mutanti: mutanti produttori mutanti costitutivi mutanti auxotrofi

Mutanti produttori (produzione di antibiotici) producono quantità molto più elevate di un determinato antibiotico Per isolare mutanti iperproduttori di un dato antibiotico, efficace nei riguardi di un dato microrganismo, si utilizza quest’ultimo come indicatore. Si seminano su terreno opportuno tutte le cellule sopravvissute al trattamento mutageno, e, una volta che le colonie si sono sviluppate, si semina il microrganismo indicatore. I mutanti iperproduttori si riconoscono per il maggiore diametro dell’ alone di inibizione, cioè di quell’area circolare intorno alla colonia dove non è avvenuta la crescita del microrganismo indicatore.

Mutanti costitutivi (produzione di enzimi) Presentano difetti di regolazione: esempio incapacità ad esprimere il repressore attivo, pertanto la produzione dell’enzima da inducibile diventa costitutiva. Isolamento diretto : determinazione dell’attività enzimatica in assenza di induttore Anche attraverso coltura continua utilizzando l’induttore come substrato limitante. Poiché il substrato limitante è presente a conc. molto basse, al di sotto della soglia di induzione, il mutante costitutivo avrà un vantaggio selettivo sul wild type.

Mutanti auxotrofi (produzione di amminoacidi) Via biosintetica E1 E2 E3 E4 Rifornendo di 5 in conc. limitanti si avrà crescita, ma non inibizione/repressione, si accumula l’intermedio 3 Mutanti che acquisiscono un’esigenza nutrizionale in seguito alla perdita di un’attività enzimatica necessaria alla biosintesi di una molecola essenziale. Possono accumulare intermedi metabolici. Isolamento indiretto: confronto della crescita delle colonie su terreni selettivi e non selettivi (replica plating)

2. Ricombinazione Processo che produce nuove combinazioni di geni originariamente presenti in individui diversi. Il vantaggio dell’utilizzo di tecniche di ricombinazione consiste nella possibilità di ottenere una grande variabilità nella progenie. Eucarioti: Ricombinazione sessuale (incroci) Procarioti: Coniugazione Trasformazione Trasduzione Procarioti ed eucarioti: Fusione dei protoplasti

Fusione dei protoplasti

Tecnologia del DNA ricombinante Insieme delle tecniche e delle procedure per l’isolamento, la manipolazione e l’espressione di materiale genetico (DNA e RNA). E’ possibile isolare geni e trasferirli a cellule di organismi diversi, effettuare cioè la cosiddetta espressione eterologa di un gene. 3. Ingegneria genetica Vantaggi dell’espressione eterologa: Consente di aumentare la disponibilità di proteine rare Consente di utilizzare per la produzione di queste proteine microrganismi di facile coltivazione Svantaggi dell’espressione eterologa: La qualità del prodotto ricombinante può essere diversa da quella del prodotto nativo I costrutti ricombinanti sono instabili Le regolamentazioni legislative sono severe

Clonaggio di un gene è un termine che descrive una serie di tecniche con le quali è possibile ottenere più copie di una determinata sequenza nucleotidica Il gene per essere clonato deve essere legato ad un vettore La tecnica di clonaggio risale agli anni '70 e utilizza gli enzimi di restrizione e i vettori di clonaggio

Sono enzimi (endonucleasi sequenza-specifiche), isolati generalmente da batteri, in grado di riconoscere e tagliare/digerire il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche dette “siti di restrizione”. I siti di restrizione sono sequenze ripetute invertite (palindromi), che risultano essere uguali se lette nella stessa polarità. I batteri producono enzimi di restrizione essenzialmente per difendersi da DNA estraneo. Gli enzimi di restrizione

I vettori plasmidici sono molecole circolari di DNA a doppia elica (< di 10k bp), ottenuti dalla modificazione di plasmidi naturali, capaci di replicazione autonoma, possono essere presenti in elevato numero di copie I vettori plasmidici sono caratterizzati da: sequenze artificiali (polylinker) con numerosi siti di restrizione sequenze per la selezione (es: resistenza ad un antibiotico) Vettori di clonaggio (plasmidici)

Clonaggio di un gene eucariotico : sintesi del cDNA

4. Ingegneria metabolica e systems biotechnology: un approccio globale

Metabolic engineering (Bailey, 1991) is the directed improvement of product formation or cellular properties through the modification of specific biochemical reactions or introduction of new ones with the use of recombinant DNA technology. An essential element the identification of the biochemical reactions targeted for modification or to be newly introduced. Once such reaction targets are identified, molecular biological techniques are applied in order to amplify, inhibit or delete, transfer, or deregulate the corre- sponding genes or enzymes.

Esempio ingegneria metabolica: S. cerevisiae per la produzione di acido lattico, cap. 7

Attualmente, l’approccio della systems biotechnology utilizza le metodologie «omiche»