PRODOTTI del metabolismo microbico: Metaboliti primari o prodotti associati alla crescita Metaboliti secondari o prodotti non associati alla crescita Nei metaboliti primari (etanolo, acido lattico, etc), il profilo di concentrazione del prodotto segue quello della massa microbica (metaboliti associati alla crescita. Questo non accade per i metaboliti secondari che sono, quindi, non associati alla crescita. Figure: 30-02 Caption: Contrast between production of primary and secondary metabolites. (a) Alcohol formation by yeast—an example of a primary metabolite. (b) Penicillin production by the mold Penicillium chrysogenum—an example of a secondary metabolite. Note how penicillin is not made until after mid-log phase (Figure 6.8).

Crescita microbica Crescita di una popolazione in determinate condizioni colturali: aumento del numero (N) delle cellule (unicellulari) o delle massa (X) (unicellulari e funghi miceliari) Sono necessari: inoculo vitale terreno appropriato (fonte di energia, di C, altri nutrienti) assenza di inibitori condizioni chimico-fisiche opportune

Crescita bilanciata La crescita è bilanciata se comporta l’incremento ordinato di tutti i componenti cellulari, per cui la composizione chimica delle cellule figlie risulta essere uguale a quella delle cellule madri. un aumento della massa microbica non è necessariamente indicativo di una crescita perché esso può dipendere da accumulo di sostanze di riserva (per es. poli b-idrossibutirrato nei batteri o glicogeno nei lieviti) si ha crescita bilanciata solo in presenza di: un inoculo vitale e ben adattato al terreno di coltura concentrazioni idonee (saturanti) di nutrienti condizioni chimico-fisiche ottimali (pH, temperatura, O2 etc.) e assenza di inibitori

Le colture che sostengono una crescita bilanciata mantengono una composizione chimica costante. In queste condizioni, la velocità della reazione di crescita può essere rappresentata come segue: Dove: * RNA, DNA, proteine, acqua intracellulare, etc.

In condizioni bilanciate, la crescita può essere considerata come una reazione autocatalitica (reagente e prodotto sono, infatti, entrambi costituiti dalla massa microbica che promuove la propria crescita) caratterizzata da una cinetica del primo ordine: Dove m [t-1] è la costante di velocità della reazione o velocità di crescita specifica (velocità di crescita per unità di biomassa). La m risulta essere costante solo se la crescita microbica avviene nelle condizioni precedentemente illustrate, in tal caso corrisponde al valore massimo di m e si indica con m max (1) (2)

Separando le variabili e integrando la (1) tra t0 e t avremo: Per t0 = 0 (5) (6) (4) (3) lnx m = mmax lnx0 (B) x0 x Ovvero:

Tempo di generazione Se nella (5) sostituiamo il valore di x con 2x0, possiamo calcolare il tempo di generazione tg : tg è il “tempo di generazione o duplicazione” ovvero il tempo necessario perché la cellula (o la popolazione) si duplichi.

Considerando N, il numero delle cellule, che raddoppia ad ogni duplicazione cellulare, possiamo scrivere: Nt = N0 x 2n ln Nt = ln N0 + n ln 2 Tempo [h] ln Nt m = 0,693/tg ln N0

Velocità di crescita specifica Tempo di generazione mmax [h-1] tg[h] Hybridoma 0.05 13.9 Cellule di insetto 0.06 11.6

La curva di crescita in coltura batch Fase di latenza (lunghezza che dipende da età inoculo, composizione terreno) Fase di accelerazione Fase log o esponenziale (fase a velocità costante e massima, saturazione delle permeasi) Fase di declino o rallentamento Fase stazionaria (esaurimento nutrienti, accumulo sostanze tossiche, è preceduta da una fase sbilanciata di crescita, accumulo sostanze di riserva) Fase di morte (cinetica del primo ordine)

La curva di crescita in coltura batch fase lag o di latenza adattamento alle condizioni colturali, dipende dalla natura e dall’età dell’inoculo di accelerazione m aumenta esponenziale o logaritmica (eq.5) m è costante di declino m diminuisce, diminuzione della conc. di S, inizio accumulo di sostanze tossiche stazionaria esaurimento di S, accumulo sostanze tossiche di morte non sempre presente

La crescita diauxica Di regola, quando sono presenti 2 fonti di carbonio (S1 e S2), non vengono utilizzate contemporaneamente ma in successione n.b. Il plateau che si osserva alla fine della prima fase esponenziale in cui la crescita è nulla dipende dal tempo richiesto per la sintesi degli enzimi che promuovono la demolizione del substrato S2

Crescita diauxica di S. cerevisiae su glucosio ed etanolo (crescita aerobica su glucosio) fase 1: esponenziale di crescita su glucosio (conc. iniziale 9.5 g/l), dopo l’esaurimento di quest’ultimo, fase 2: respirazione dell’etanolo prodotto nella fase 1.

Metodi di determinazione della crescita microbica Metodi per la determinazione della biomassa: Peso secco la determinazione del peso secco si effettua portando, dopo alcuni lavaggi in H2O, la sospensione cellulare a 105 °C fino a raggiungimento di un peso costante Spettrofotometria (turbidimetria)

Determinazione della biomassa: metodo turbidimetrico Determinazione dell’ assorbanza o densità ottica: A = k . c .l A = log I0/I k = costante di proporzionalità l = cammino ottico (in genere pari a 1 cm) c = densità della sospensione cellulare Lunghezza d’onda impiegata: 590-600 nm Figure: 06-12a Caption: Turbidity measurements of microbial growth. (a) Measurements of turbidity are made in a spectrophotometer or photometer. The photocell measures incident light unscattered by cells in suspension and gives readings in optical density or photometer units.

Curva standard D.O. 590 vs. peso secco

Metodi di determinazione del numero delle cellule Conteggio diretto al microscopico ottico Camera di Burker: a = 1/400 mm2 h = 0,1 mm = 1/10 mm V = 1/4.000 mm3 Camera di Petroff-Hauser: a = 1/400 mm2 h = 0,02 mm =1/50 mm V = 1/20.000 mm3

Metodi di determinazione del numero delle cellule Conta vitale o conta su piastra: determinazione delle colony forming units (CFU) Figure: 06-10 Caption: Two methods of performing a viable count (plate count). In either case the sample must usually be diluted before plating.

Determinazione delle CFU in grandi volumi di liquido (es: analisi microbiologica delle acque)

Fattori che influenzano la velocità di crescita specifica, m Temperatura pH Attività dell’acqua Composizione del mezzo di coltura Concentrazione di S (eq. di Monod) Ossigeno disciolto

Fattori che influenzano m: temperatura dove: A = costante di Arrhenius Ea = energia di attivazione R = costante dei gas T = temperatura assoluta E. coli

In figura, andamento della velocità di crescita in funzione della temperatura, nei microrganismi: Psicrofili:- 5-15 °C; Mesofili: 20-40 °C; Termofili: 45-70 °C; Ipertermofili >70 °C Figure: 06-17 Caption: Relation of temperature to growth rates of a typical psychrophile, a typical mesophile, a typical thermophile, and two different hyperthermophiles. The temperature optima of the example organisms are shown on the graph.

Fattori che influenzano m: pH Batteri = 6.5-7.5 5.0-8.5 Lieviti = 4.0-5.0 2.5-8.5 Muffe = 5.0-7.0 3.0-8.5 Il pH diminuisce quando vengono prodotti acidi organici (ad es. ac. lattico, citrico, acetico) o quando NH4 + viene usato come fonte di azoto perché lo ione viene incorporato come R-NH3+ e viene rilasciato un H+. Al contrario, il pH aumenta se NO32- è usato come fonte di azoto, poiché gli H+ del mezzo vengono consumati per ridurre l’azoto.

Fattori che influenzano m: attività dell’acqua (Aw) o frazione molare efficace di solvente presente nella soluzione p = tensione di vapore del solvente sulla soluzione p0 = tensione di vapore del solvente puro Osmolalità = numero di osmoli di soluto per Kg di solvente dove 1 osmole è il numero di particelle osmoticamente attive che, quando sciolte in 22.4 l di solvente a 0 °C, esercita la pressione di una atmosfera. Le muffe sono in grado di riprodursi ai più bassi valori di attività dell’acqua rispetto ai comuni batteri

Fattori che influenzano m: composizione del terreno m è maggiore in terreni complessi