Classificazione delle fermentazioni dal punto di vista cinetico: batch o discontinua Fi = Fo= 0 continua Fi = Fo = F > 0 fed-batch o semi-continua Fi > 0, Fo = 0

Fermentazione continua Fi = Fo = F > 0 F portata volumetrica [m3 h-1] V volume [m3] F/V = D velocità di diluizione [h-1] V/F = t tempo di residenza [h] X, S, P conc. [kg m-3] X =0 S= Si F X S P

Fermentatore funzionante in continuo (chemostato)-CSTR Volume costante Miscelazione perfetta Temperatura e pH ottimali e costanti Alimentazione sterile Singolo substrato limitante la crescita Rese costanti Morte cellulare trascurabile

2. D = mmax sistema instabile 3. D < mmax steady–state Prima di avviare l’alimentazione a monte e il prelievo della brodocoltura a valle, si inocula il brodo sterile con il microrganismo lasciando che parta la crescita esponenziale. Quando questa è ancora in corso, al tempo t1 si avvia l’alimentazione. I casi che si possono verificare sono tre: D >mmax wash-out 2. D = mmax sistema instabile 3. D < mmax steady–state

Caso 3 Al tempo t1 quando ancora m = mmax (0.4 h-1), si avvia l’alimentazione con brodo fresco ad un valore di Fi = Fo = F = 0.1 l h -1 tale per cui F/V = D = 0.1 h-1. Quando parte l’alimentazione, S è ancora saturante, quindi la crescita sarà per un certo tempo esponenziale poi la m comincerà a diminuire. Infatti, per effetto della crescita, S sarà consumato e la sua concentrazione diminuirà. Se S diminuisce, l’equazione di Monod ci dice che anche m diminuirà fino ad arrivare ad un valore pari a quello di D (0.1 h-1), cioè la velocità specifica di crescita del microrganismo eguaglierà la velocità specifica di ricambio della brodocoltura. In queste condizioni sarà raggiunto lo stato stazionario, la concentrazione cellulare non cambia, così pure quella del substrato residuo nel fermentatore, ovvero, dx/dt = 0 e ds/dt = 0.

Con il sistema continuo, variando la portata volumetrica dell’alimentazione, è possibile, rendere costante, nel tempo, qualsiasi valore di m compreso nell’intervallo tra 0 e mmax (esclusi gli estremi) e. di conseguenza, qualsiasi valore di qs e qp (se il prodotto è associato alla crescita). Il sistema continuo è utilizzato per studi di carattere fisiologico perché consente di - verificare l’effetto della variazione della m sulla fisiologia del microorganismo. - fissata la m, di studiare l’effetto di parametri fisico- chimici come pH, aerazione, etc. sulla fisiologia del microrganismo.

poiché F/V = D, possiamo scrivere: Si opera ad un valore di F in modo che Si è aggiunto ad una velocità inferiore alla velocità di consumo massimo della coltura, questa diventa limitata da S, in accordo con l’eq. di Monod. La condizione per la quale m è limitata da S è: F Si /V < qs,max Xmax Cioè la velocità di input di S deve essere inferiore alla velocità massima di consumo di S da parte della biomassa, poiché F/V = D, possiamo scrivere: D Si < qs,max Xmax D Si < mmax Xmax /Yx,s D Si < mmax Si D < mmax (Kg m-3 h-1) Per ogni valore di D < mmax si raggiunge un diverso stato stazionario dX/dt =0 dp/dt =0 ds/dt =0 dDOT/dt =0

Velocità di crescita specifica: bilancio relativo alla biomassa I processi continui funzionano allo stato stazionario, per cui i diagrammi delle variabili di processo contro il tempo sono di scarsa utilità, più significativo è lo studio di y = f(D). Tali diagrammi sono ottenuti mediante soluzioni analitiche delle equazioni di bilancio per lo stato stazionario. Velocità di crescita specifica: bilancio relativo alla biomassa D è la variabile di controllo principale del chemostato La velocità di crescita specifica è controllata dalla velocità di diluizione Si non ha alcun effetto su m

Concentrazione, allo stato stazionario, di S, il substrato limitante La legge di Monod è sempre valida e costituisce il prerequisito per il funzionamento della coltura continua. La stessa è utilizzata per esprimere come, in un fermentatore in continuo, S vari al variare di D. Riarrangiando l’equazione di Monod (1) in modo da esprimere S in funzione di m si ha: Poiché allo stato stazionario m = D, si ha: La concentrazione di S allo stato stazionario non dipende da Si, cioè dalla conc. di S nel serbatoio di alimentazione

La densità cellulare, x, allo stato stazionario: bilancio sul substrato Mentre la concentrazione del substrato limitante allo s.s. è ottenuta dalla legge di Monod, la concentrazione della biomassa allo stato stazionario è ottenuta dall’equazione di bilancio sul substrato limitante La conc. della biomassa allo s.s. è indipendente da D (eccetto ad alti valori di D), dipende dalla resa e dal substrato consumato

Effetto della velocità di diluizione sulle variabili di processo X, S. 1 2 2 X2 1 X1 Effetto della velocità di diluizione sulle variabili di processo X, S. Il profilo di X al variare di D mostra che X è costante in un ampio intervallo di D. Il profilo di S al variare di D indica che, con una ks piccola, S si mantiene vicino allo zero in un ampio intervallo di valori di D, fino a quando D non raggiunge un valore critico, in corrispondenza del quale [S] = [Si]. Allora, si verifica il wash out.

Dcrit è il valore minimo di D per il quale si ha il wash-out

Controllo metabolico nella coltura continua - Autoregolazione Il chemostato è autoregolante Controllo metabolico nella coltura continua - Autoregolazione Nel chemostato, una diminuzione di portata volumetrica (a causa per es. di un crollo di tensione) determina, nel reattore, un aumento momentaneo di X (infatti, si riduce il prelievo a valle) e una riduzione di S, (diminuisce, infatti, la portata di alimentazione al fermentatore). La risposta metabolica a una diminuzione di S è una diminuzione di m secondo Monod. Quindi, il disturbo che determina un aumento di X è controbilanciato da un effetto metabolico che riduce la concentrazione cellulare. Tale risposta continuerà fino a quando la velocità di crescita specifica non si sarà ridotta al valore numerico della nuova velocità di diluizione. In queste condizioni, lo steady-state è ripristinato ma a un valore inferiore di D. Avverrà il contrario se, invece della diminuzione si verifica un aumento della portata volumetrica.

Produttività relativa alla biomassa E’ la velocità volumetrica di produzione di biomassa rx (Kg m-3 h-1)     Dmax è calcolabile in quanto è il valore di D in corrispondenza del quale la derivata prima della funzione rx = Dx è zero. In continuo si può operare in modo che la produttività sia massima e costante nel tempo

Equazione di Leudeking-Piret: qp = am + b Metaboliti primari o prodotti associati alla crescita Metaboliti secondari o prodotti non associati alla crescita Figure: 30-02 Caption: Contrast between production of primary and secondary metabolites. (a) Alcohol formation by yeast—an example of a primary metabolite. (b) Penicillin production by the mold Penicillium chrysogenum—an example of a secondary metabolite. Note how penicillin is not made until after mid-log phase (Figure 6.8). Equazione di Leudeking-Piret: qp = am + b Per b= 0 : qp = am a = Yp,x Per a=0 : qp = b

Concentrazione del prodotto: bilancio relativo al prodotto Per b= 0 : p (s.s) = ax (s.s) Considerando : qp = am + b p (s.s) = bX (s.s.)/D Per a= 0 :

Solo prodotti legati alla crescita sono adatti per la produzione in continuo, infatti, quelli non legati alla crescita, ad alti valori di D, risultano molto diluiti. Prodotto parzialmente associato alla crescita 2. Prodotto associato alla crescita 3. Prodotto non associato alla crescita

Vantaggi della fermentazione continua Mantenimento della coltura a m costante studi fisiologici (es: distinguere tra gli effetti dovuti a cambiamenti di m e quelli dovuti ad altri fattori) E’ possibile determinare costanti cinetiche come Ks, altrimenti non valutabili Controllo del processo Produttività costante ed elevata (rx, rp, se p è associato alla crescita) Svantaggi della fermentazione continua Rischio di contaminazione Rischio di instabilità genetica del ceppo Diluizione del prodotto

Selezione di mutanti in chemostato

Fermentazione semicontinua o fed-batch Avviene in un reattore batch alimentato con una soluzione nutriente in modo che un componente (in genere la fonte di carbonio) sia limitante. La condizione per la limitazione della crescita è la stessa che per il continuo con la differenza che cambia nel tempo: Perché usare il fed-batch? per raggiungere elevate densità cellulari per evitare limitazioni legate alla capacità del fermentatore di raffreddare e/o trasferire O2 3. per controllare il metabolismo, evitando così fenomeni di over-flow metabolico

Gestione di un fed-batch Fase batch: la crescita avviene esponenzialmente Fase fed o di alimentazione: a questo punto, si avvia l’alimentazione a una velocità tale da determinare la limitazione da substrato e, quindi , da controllare la velocità di crescita. Il profilo di alimentazione può essere esponenziale (m costante e crescita esponenziale) o costante (m decrescente e crescita lineare) Profilo esp. e poi costante Profilo costante s x m

Fed-batch: bilanci di materia Nel fed batch non si raggiunge un vero stato stazionario per cui non possono essere usate le stesse soluzioni analitiche impiegate per il chemostato. Le equazioni vanno risolte numericamente a partire da valori iniziali dati . Il termine –F/V non rappresenta la velocità di allontanamento della componente y ma la sua velocità di diluizione all’interno del reattore.

Vantaggi della fermentazione fed-batch La condizione di limitazione da S, come in continuo, permette di: controllare la velocità di crescita, evitando limitazioni legate alla capacità del fermentatore di trasferire O2 controllare il tipo di metabolismo es: evitare l’overflow metabolico in modo da ottenere alte densità cellulari (High Cell Density Cultures) In più, vengono mantenuti i vantaggi del batch: mantenimento della sterilità mantenimento della stabilità genetica del ceppo elevata concentrazione del prodotto

Controllare la velocità di crescita, evitando limitazioni legate alla capacità del fermentatore di trasferire O2 1.Nella maggior parte delle produzioni industriali che avvengono per via microbiologica, viene favorito il metabolismo respiratorio perché la resa in biomassa (Yx/s) è più elevata. Se la coltura cresce esponenzialmente, anche la produttività cresce esponenzialmente, essendo rx = m.X Se la brodocoltura respira, la velocità con cui l’ossigeno viene consumato è proporzionale alla produttività cellulare, essendo L’ossigeno consumato è presente nella fase liquida dove esso viene trasferito dalla fase gassosa. La velocità volumetrica di trasferimento dell’ ossigeno dalla fase gassosa a quella liquida deve essere sempre ≥ della velocità volumetrica di consumo di ossigeno da parte della brodocoltura in crescita.

2. Poichè la capacità di trasferimento di O2 (velocità volumetrica di trasferimento) da parte del fermentatore non è illimitata, esisterà un valore di produttività di biomassa, “critico” (rxcrit.) in corrispondenza del quale la velocità di consumo dell’ossigeno non riuscirà ad essere controbilanciata da un adeguato trasferimento di ossigeno da parte del fermentatore In figura sono rappresentate crescite esponenziali, a valori di m differenti. Le velocità specifiche sono 1.4, 0.69 0.35 h-1, rispettivamente. Le frecce indicano una ipotetica produttività critica di 5 kg m-3h-1 che viene raggiunta tanto più rapidamente quanto più elevata è la m, ma a una densità cellulare tanto minore quanto maggiore è la m. Se non interviene nulla a ridurre la velocità della reazione di crescita, la crescita può arrestarsi per insufficienza di ossigeno. Il fed-batch offre la possibilità di questo controllo e permette,così,il proseguimento della crescita e l’ottenimento di elevate densità cellulari nel reattore.

Il lievito per panificazione: 2,5 milioni di tonnellate/anno C6H12O6 = 2 CH3CH2OH + 2 CO2

Effetto glucosio o metabolismo di overflow in S. cerevisiae : In presenza di O2 respirazione C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O solo se [C6H12O6] < 30-50 mg/l se [C6H12O6] > 30-50 mg/l, si ha metabolismo overflow fermentazione aerobica o ossidativa ossidazione incompleta Se qs = 0,6 h-1 (ovvero m = 0,3 h-1) + Acetato

1 Produzione di lievito per panificazione (baker’s yeast)

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