Il potenziale d’azione Significato funzionale: E’ la risposta ad uno stimolo depolarizzante che possono dare cellule elettricamente eccitabili, cioè provviste di un corredo di canali ionici voltaggio-dipendenti per il Na+ e per il K+ Significato funzionale: Nei neuroni – segnale elettrico che propagandosi lungo la fibra nervosa consente la trasmissione di messaggi elettrici a livello del SN Nelle fibrocellule muscolari – innesca il processo della contrazione La Biofisica dei canali ionici è storicamente legata alla comprensione dei meccanismi che generano i POTENZIALI D’AZIONE nelle cellule eccitabili. NB: durante il pda la membrana si trova in condizioni dinamiche (e non statiche, come abbiamo fatto finora considerando il RP.

Per ottenere una rappresentazione corretta del pda, occorre effettuare delle derivazioni intracellulari, fatte da singoli elementi cellulari. Dapprima furono realizzate (con elettrodi metallici) dagli assoni giganti dei molluschi Cefalopodi (calamaro, seppia) … poi (con microelettrodi di vetro) da tutte le cellule eccitabili

A dispetto di una notevole variabilità tra tipi cellulari diversi, i pda presentano tutti alcune proprietà fondamentali. Le note proprietà dei pda (richiamo) L’eccedenza (overshoot). Consiste in un’inversione temporanea del potenziale di membrana: Al picco del pda il pdm è +35 mV circa

Le note proprietà dei pda (richiamo) La soglia. NB per stimolare, occorre depolarizzare la membrana, cioè applicare una corrente che apporti cariche positive all’interno della cellula. (Stimoli sottoliminari e sovraliminari) Lo stimolo soglia è lo stimolo depolarizzante di intensità minima in grado di generare un potenziale d’azione

Le note proprietà dei pda (richiamo) la “legge” del tutto-o-del-nulla (analogia con lo sparo di un’arma da fuoco). In un neurone un potenziale d’azione o è generaro e si sviluppa in tutta la sua ampiezza, se lo stimolo raggiunge o supera la soglia, oppure non è generato affatto, se l’ampezza dello stimolo è inferiore alla soglia.

Le note proprietà dei pda (richiamo) La refrattarietà: la soglia è inizialmente elevatissima, ma poi, in una decina di msec, ritorna al livello normale). Refrattarietà assoluta Refrattarietà relativa

Soglia Legge del tutto o nulla Refrattarietà con HHsim http://www.cs.cmu.edu/~dst/HHsim/

Basi ioniche del potenziale d’azione • conduttanze e correnti di Na voltaggio-dipendenti • conduttanze e correnti di K voltaggio-dipendenti

Qual è il ruolo dei canali del Na+ nella genesi del potenziale d’azione? 1. Osservazione di Hodgkin e Huxley (1939): – al picco di un potenziale d’azione il potenziale di membrana diventa transitoriamente positivo all’interno – eccedenza o overshoot. 2. Ipotesi: è coinvolto il Na – l’entrata di Na attraverso la membrana continuerà fino al raggiungimento del potenziale di equilibrio del Na (ENa). ENa = 58 log ([Na]o / [Na]i) = 58 log (460/50) = 59 mV 50% [Na]o -> ENa =? (38 mV) 33% [Na]o -> ENa =? (28 mV) 3. Esperimento di Hodgkin e Katz (1949): riducendo [Na]o  riduzione dell’overshoot PK : PNa : PCl Al potenziale di riposo 1.0: 0.04: 0.45 Al picco del PA 1.0 : 20 : 0.45 Conclusione: Il potenziale d’azione è il risultato di un grande e transitorio aumento nella permeabilità al Na della membrana.

Il potenziale di membrana ritorna verso EK Che dire della fase di caduta del potenziale d’azione? - 1a ipotesi: I canali del Na semplicemente si chiudono (inattivazione) Ma se fosse solo questo la ripolarizzazione sarebbe più lenta di quanto osservato sperimentalmente Il potenziale di membrana ritorna verso EK Il potenziale di membrana iperpolarizza (diventa più negativo del potenziale di riposo) per un certo tempo - Ipotesi aggiuntiva: Si verifica un successivo grosso aumento della permeabilità della membrana al K dovuto all’apertura di canali del K voltaggio-dipendenti.

gNa = INa / (Vm – ENa) Ipotesi di Hodgkin e Katz: La depolarizzazione della cellula al di sopra del valore di soglia causa un breve aumento della permeabilità della membrana agli ioni Na. In che maniera la permeabilità di membrana agli ioni Na varia con il potenziale di membrana? Esperimento: Misurare l’ampiezza della corrente (I) che fluisce attraverso la membrana a diversi livelli del potenziale di membrana (Vm) depolarizzazione Canali Na aprono INa entr. gNa = INa / (Vm – ENa) Problema 1: La corrente fluisce attraverso la membrana  il potenziale di membrana cambia  la conduttanza della membrana si modifica Esiste forte interdipendenza del PM e del gating dei canali del Na e del K  sia il PM che la conduttanza dei canali cambiano costantemente. Per risolvere questo problema, K. Cole sviluppò la tecnica del voltage-clamp.

Alan Hodgkin ed Andrew Huxley formularono un modello sulla genesi del pda, Sulla base dei dati ottenuti sulle correnti di K e di Na voltaggio-dipendenti derivate mediante la tecnica del “blocco del voltaggio” (voltage clamp, VC). Sarà il caso di vedere che cos’è il VC e capire perché dev’essere applicato per studiare in modo approfondito il comportamento dei canali ionici (voltaggio-dipendenti e non). In una membrana eccitabile, accanto ai canali di leakage (gL), sono presenti canali ionici selettivi per il Na+ e per il K+ (gNa e gK) che sono sia voltaggio- che tempo-dipendenti. Che cosa ci dice il pdm che misuriamo sulle correnti ioniche che attraversano la membrana (cioè sul comportamento dei canali ionici) ? - - MOLTO POCO!! La questione non è banale, perché entrano in gioco le “proprietà elettriche passive” della membrana.

Dal punto di vista elettrico, infatti, una membrana presenta: a) una resistenza Rm (una conduttanza gm=1/Rm): la resistenza offerta al passaggio di cariche elettriche dai canali ionici che si trovano nello stato aperto) b) una capacità Cm: infatti il doppio strato fosfolipidico è capace di mantenere separate le cariche elettriche, come farebbero le armature di un condensatore. Che cosa succede al pdm quando facciamo passare attraverso la membrana un corrente di intensità nota ?

NeuroLab Simulazioni con (time constants) http://www.cudos.ac.uk/web/neurolab/exhibits.htm Nota: Current; R1=max, R2=max, C=var

Comportandosi la membrana come un condensatore, in seguito ad uno stimolo elettrico il potenziale di membrana Vm non cambia istantaneamente ma impiega un certo tempo per passare dal suo valore iniziale Vo al suo valore finale Vf

Condizione di “current clamp” - Immaginiamo di iniettare nella membrana un impulso di corrente (Im). Se ci fosse solo Rm, anche il pdm (Vm) sarebbe un impulso (Vm=ImRm: legge di Ohm). Invece, per la presenza di Cm: allo “step-on”, Vm raggiunge il valore stazionario (Vm=ImRm) secondo una funzione esponenziale, quindi con una velocità molto inferiore a quella con cui viene applicata la corrente. Allo “step-off”, Vm ritorna al valore di riposo con lo stesso andamento esponenziale. Perché ?

Im si divide in due componenti: una corrente capacitiva (IC) che serve a caricare Cm, ed una corrente resistiva o ionica (IR) che fluisce attraverso Rm. Queste due componenti evolvono nel tempo con leggi diverse IR = Vm/Rm IC = C·dVm/dt Nell’ istante iniziale, la corrente capacitiva (o “corrente di spostamento” IC = C dVm/dt) è massima e la corrente resistiva (o “ohmica” IR = gmVm, immaginando di trascurare il potenziale di riposo) è minima, e cioè: praticamente tutte le cariche iniettate vanno sulle armature del condensatore -ed iniziano a caricarlo-, e nessuna va nella resistenza. Man mano che il tempo passa, Cm continua a caricarsi, quindi Vm aumenta: di conseguenza le cariche passeranno sempre più “volentieri” attraverso la resistenza (IR aumenterà) e sempre meno “volentieri” si accumuleranno sul condensatore (IC diminuirà). Alla fine ….

Im = IC + IR = C dVm/dt + Vm/Rm In termini matematici: la risoluzione della semplice equazione differenziale:   Im = IC + IR = C dVm/dt + Vm/Rm ci assicura che Vm varierà con legge esponenziale. Allo step-on, Vm=V∞ [1-exp(-t/RmCm)] ed allo step-off Vm=V∞ [exp(-t/RmCm)] dove V∞ = Im·Rm (legge di Ohm, quando il condensatore è completamente carico). Il prodotto Rm·Cm è chiamato τ : la costante di tempo della membrana. τ esprime il tempo impiegato per raggiungere il 63% del valore finale. NB. All’aumentare della superficie della m, Rm diminuisce mentre Cm aumenta.

Potenziale d’azione - 9 Oggi sappiamo che queste proprietà derivano dall’esistenza nelle membrane eccitabili di due famiglie di canali ionici voltaggio-dipendenti, una selettiva per il Na+, l’altra per il K+. Quando la m. viene depolarizzata dallo stimolo, i canali del Na+ si aprono (e gNa aumenta in modo autorigenerativo). Questa corrente entrante di Na+ determina la prima fase del pda, fino ad invertire il pdm. Successivamente i canali del Na+ che si sono aperti passano nello stato inattivato; e gNa si spegne. Nel frattempo però la forte depolarizzazione (ed inversione) del pdm ha cominciato ad aprire i canali del K+, per cui anche gK aumenta, sebbene con ritardo rispetto a gNa. Questa corrente uscente di K+ dapprima ripolarizza la membrana. …e poi determina l’ iperpolarizzazione postuma (afterpotential) Col ritorno del pdm ai valori di riposo: a) i canali del K+ (aperti) ritornano nello stato chiuso; b) i canali del Na+ (inattivati) ritornano nello stato chiuso. Il sistema è “resettato”. Tutto questo, nell’assone gigante di calamaro, avviene in pochi millesimi di secondo.