Adesione e giunzioni cellulari 2011

S S   Integrin Ca 2+ -dependent binding Ca 2+ -dependent binding Heterophil connection Heterophil connection Focal contacts Focal contacts Its i.c. linker proteins are Its i.c. linker proteins are i.e.. talin,  -actinin, vinculin i.e.. talin,  -actinin, vinculin RGD sequ. Is significant in RGD sequ. Is significant in e.c. binding e.c. binding Partner molecules: Partner molecules: fibronectin fibronectinlaminincollagen Deficiency (  ) – the adhesion of leukocytes affected, results the increase of inflammations

Le integrine sono una famiglia di CAMs eterofile che legano IgSF CAMs o la matrice extracellulare. Si tratta di proteine eterodimeriche costituite da una subunità alfa e una beta unite da legame non-covalente. Sono state individuate 24 diverse subunità alfa e 9 differenti subunità beta, sebbene non siano state osservate tutte le combinazioni possibili. Ogni subunità è costituita dai domini extracellulare, transmembrana ed intracellulare. Dominio intracellulare : è costituito da due bracci (uno per subunità) che possono essere definiti meccanico, in quanto in risposta a determinati segnali agisce sui filamenti di actina ectoplasmatici, e biochimico, in quanto induce particolari attività enzimatiche in relazione al segnale ricevuto. Dominio transmembrana: è il vero punto di snodo tra l'ambiente "fuori" dalla cellula e l'ambiente "dentro" la cellula, dove si verificano interazioni meccaniche tra gli altri due domini dell'integrina. Dominio extracellulare: È capace di riconoscere (e legare) ioni bivalenti come Ca ++ e Mg ++ inoltre riconosce e lega la fibronectina contatti focalicontatti focali, emidesmosomi, lamine esterne e membrane basali.emidesmosomilamine esterne e membrane basali

LE INTEGRINE Dominio intracellulare: è costituito da due bracci (uno per subunità) che possono essere definiti meccanico, in quanto in risposta a determinati segnali agisce sui filamenti di actina ectoplasmatici, e biochimico, in quanto induce particolari attività enzimatiche in relazione al segnale ricevuto. Dominio transmembrana: è il vero punto di snodo tra l'ambiente "fuori" dalla cellula e l'ambiente "dentro" la cellula, dove si verificano interazioni meccaniche tra gli altri due domini dell'integrina. Dominio extracellulare: È capace di riconoscere (e legare) ioni bivalenti come Ca ++ e Mg ++ inoltre riconosce e lega la fibronectina

beta1 beta2 beta3 beta4 beta5 beta6 beta7 beta8 alpha alpha alpha alpha alpha alpha alpha alpha alpha alphaD alphaL alphaM alphaV alphaX alphaIIb alphaIELb Subunità di integrine e loro combinazioni

LE INTEGRINE COLLEGANO LA MATRICE EXTRACELLULARE AL CITOSCHELETRO  ECM RGD Arg-Gly-Asp (RGD)

SITO DI RICONOSCIMENTO DI Arg-Gly-Asp (RGD)

actina  -actinina vinculina paxillina talina proteina capping integrina ADESIONI FOCALI

actin vinculin talin  -actinin zyxin paxillin tensin sarc fak others MOLECOLE DEI CONTATTI FOCALI

membrana integrina matrice extracellulare citosol adesione cellula-matrice

Integrins & Disease Humans: Leukocyte adhesion deficiency Genetic defect Can't make Beta2 Subunit WBCs can't stick to endothelium; an essential initial step in fighting infections and inflammation Leads to persistent bacterial infections

IntegrinMajor ECM ligandsGene deleted Vascular phenotype by constitutive gene deletion in mice 1111 CO, LM 11 No defects in vascular development Reduced tumor angiogenesis 2121 CO, LM 22 No defects in vascular development 3131 LM, TSP 33 Perinatal lethality Defects in kidney, lung, skin but no vascular defects 4141 FN 44 Lethal at E Placental fusion defect and coronary arteries defect 5151 FN, Fibrin 55 Lethal at E 10 Vasculogenesis but no maturation/angiogenesis 6161 LM, CCN1 66 Lethal at birth No defects in vascular development 8181 FN, TN-C 88 Partial embryonic lethality No defects in vascular development 9191 TN-C 99 Lethal at birth Defects in large lymphatic vessels V1V1 FN, VN 11 Lethal at E 5.5 Failure of organizing the embryonic inner mass V3V3 FN, VN, LM, FB-Fibrin, TSP, TN- C, vWF, dCO, OPN, MMP-2, Del- 1, BSP, 33 No defects in vascular development Enhanced postnatal angiogenesis V5V5 FN, Del-1, CCN1 55 No defects in vascular development Enhanced postnatal angiogenesis ? 6464 LM 44 Lethal at birth No vascular defects in development V8V8 VN 88 Lethal at E 12 and perinatal Vascular defects in the placenta, CNS, and intestine VV

emidesmosome emidesmosome Fixing of epithelial cells to the basal membrane

actin filament  actinin vinculin paxillin talin integrin fibronectin Structure of focal contact

Figure 26: A detail of the retracting region of the cell in Fig. 24, showing sliding focal adhesions (Movie 602Kb) Click on pictur

Focal contacts actin vinculin

Extracellular Matrix

Extracellular matrix - Function Influence on migration of the cells Influence on migration of the cells Regulation of activity of molecules released Regulation of activity of molecules released Co-receptors Co-receptors

Extracellular matrix – Building blocks Glycosaminoglycans (GAG-s) Glycosaminoglycans (GAG-s)  heparan sulfate - basal membr., cell surface  keratan sulfate - cornea, bone  chondroitin sulfate – cartilage, bone, heart  hyaluronate - synovial fluid  dermatan sulfate - blood vessels, heart „Core-proteins”aggrecan – decorin „Core-proteins”aggrecan – decorin  collagen – elastin - structure  fibronectin – laminin - adhesion

Fibronectins collagen cell heparin Dimer composed by different by different channels – channels – alternative splicing RGD

Fibronectins Glycoproteins Glycoproteins Dimer-structure Dimer-structure RGD (Arg-Gly-Asp) RGD (Arg-Gly-Asp) Plasma fibronectins Plasma fibronectins Gene „K.O.” experiments Gene „K.O.” experiments Arg Gly Asp

Basal lamina Layers: lamina lucida lamina densa lamina fibroreticularis CellConnectivetissue Components:IV. collagen lamininperlecanentactin

SEM image of basal lamina basalmembrane collagenfibrils epithelialcells

Main proteins composing the basal lamina

Collagen IV Perlecan Laminin Entactin

Collagen Fibrils (diam nm) Fibrils (diam nm) More than 15 types More than 15 types I., II., III., V., XI. – formation of fibrils I., II., III., V., XI. – formation of fibrils IV., VII. – network IV., VII. – network IX., XII. – association of fibrils IX., XII. – association of fibrils

Synthesis and association of collagen filament Pro, Lys hydroxilation hydroxilation assembly formation of triple helix secretion splitting of procollagen building into fibrill fibrill organization into a fiber glycosylation synthesis of  -chain

Negative staining of collagen fibrils gaps between collagen molecules collagen

SEM image of collagen fibrils

Laminin A chain B 1 chain B 2 chain Globulardomains  helix each chain has more types each chain has more types 18 isoforms of laminin 18 isoforms of laminin diversities in tissues diversities in tissues

Elastin strech strechrelax cross-links fibre of elastin

Aggrecan One complex of aggrecan: M.W. about 10 8 M.W. about 10 8 Volume 2x ml Volume 2x ml (= bacterium) (= bacterium)

Complex of aggrecan Chondroitin sulfate Linkerproteins Coreprot. Keratin sulfate Hyaluronan 1 mm

Matrix types produced by vertebrate cells COLLAGENE IChS, DSfibrobl. IIfibronectinChSintegrinchondrocyte IIIHS, Hep.hepatocyte epithel IVlamininHS, Hep.laminin rec.epithel, endothel,regenerating hepatocyte hepatocyte VfibronectinHS, Hep.integrinresting fibrobl. VIfibronectinHSintegrinresting fibrobl. AnchorProteogly.ReceptorCells Abbr.: ChS – chondroitin sulfate; DS – dermatan sulfate; HS – heparan sulfate; Hep - heparin HS – heparan sulfate; Hep - heparin

Clinical approaches Collagen Collagen hydroxy-Pro  hydroxy-Lys  cross-linking  N-term. propeptide - poor wound healing - hyperextensibility - musculo-skeletal deformities deformities

Complexity of cell adhesion

Interactions in focal contact FimbrinNexilinTensinA-ActininTalinPaxillinCaveolinZyxinPalladinVinexinPonsin Integrin, Syndecan-4, Leukocyte common antigen

Protein associated to actin filaments Zonula adherens: E – cadherin Catetin Vinculin  -actinin Plactoglobin Adhesion plaque Integrin  -actinin VinculinTalin

Induction of integrins P PP P actin e.c. matrix activeintegrin Binding site in matrix Binding site in cytoskeleton

Communicating Gap Junctions Function Electrically connect cells Averages small molecules throughout tissue More specialized cells uncouple Connexins 4 pass transmembrane proteins 6 connexins for a functional pore: Connexon Permeability varies with connexin composition Regulation pH: Low pH closes Calcium: High calcium closes Extracellular signals: Dopamine closes

Gap Junctions Comprised of connexons Connexons made of connexins

Untreated Dopamine-Treated Lucifer Yellow Dye Transfer in Microinjected Retina Neurons

Junctions and Nonjunctional Cell-Cell Adhesion Junctional Thousands of low affinity interaction Cytoskeletal linkage stabilizes Non-Junctional May initiate junctional adhesion

MATRICE EXTRACELLULARE insieme di proteine e polisaccaridi, secrete da diversi tipi di cellule, che costituiscono strutture extracellulari in grado di svolgere diverse funzioni diversa concentrazione delle diverse componenti della matrice dà origine a strutture molto diverse tra loro (es, tendini, cartilagini dell’osso…) funzione principale di sostegno altre funzioni di regolazione della divisione cellulare, adesione, motilità e migrazione cellulare (distruzione controllata della matrice ad opera di proteasi), differenziamento durante l’embriogenesi le funzioni diverse dipendono dalle sostanze che la compongono e dalla loro particolare disposizione

Le cellule che producono le molecole della matrice sono essenzialmente fibroblasti ; In certi tipi specializzati di tessuti connettivi (cartilagine e osso) tali molecole sono secrete da cellule della famiglia dei fibroblasti più specializzate (es, condroblasti e osteoblasti)

Due classi principali di macromolecole extracellulari compongono la matrice extracellulare: - catene polisaccaridiche della classe chiamata glicosamminoglicani (GAG), che si trovano di solito uniti covalentemente a proteine sotto forma di proteoglicani - proteine fibrose, fra cui collagene, elastina, fibronectina e laminina che hanno funzioni sia strutturali che adesive. Le molecole di proteoglicano nel tessuto connettivo formano una “sostanza basale” simile a gel altamente idratata in cui le proteine fibrose sono immerse. Le fibre di collagene rafforzano e aiutano ad organizzare la matrice e fibre di elastina simili a gomma le danno elasticità.

GLICOSAMMINOGLICANI: Sono catene polisaccaridiche non ramificate composte da unità ripetute di disaccaridi. Uno degli zuccheri è sempre uno zucchero amminico (nella maggior parte dei casi è solfato). Il secondo zucchero è di solito un acido uronico (glucuronico o iduronico)

PROTEOGLICANI: Sono prodotti dalla maggior parte delle cellule animali. La catena polipeptidica, o nucleo proteico, è prodotta dai ribosomi del RER e introdotta nel lume. Le catene polisaccaridiche sono assemblate su questo nucleo principalmente nell’apparato del Golgi. Qui vengono anche aggiunti gli zuccheri.

COLLAGENI: Famiglia di proteine fibrose secrete da cellule del tessuto connettivo e da una varietà di altri tipi cellulari. Sono le proteine più abbondanti nei mammiferi (costituiscono pelle ed osso). Danno origine a fibre semicristalline che tengono in posizione le cellule, conferiscono resistenza alla tensione ed elasticità alla matrice; svolgono funzioni importanti nell’ambito della mobilità e dello sviluppo delle cellule. Glicoproteine per lo più insolubili, caratterizzate da un contenuto elevato di Gly e di 2 aa modificati: idrossi-Lys e idrossi-Pro.

Singole molecole di collagene sono strutture lineari costituite da 3 catene polipeptidiche. Le singole catene, dette catene , si avvolgono a formare un’elica sinistrorsa a passo lungo. I residui di Pro, a spaziatura regolare, sono importanti per la stabilizzazione di questa struttura elicoidale. 3 catene  si associano tra loro a formare una tripla elica destrorsa, relativamente rigida; tale struttura è possibile grazie all spaziatura regolare dei residui di Gly (stanno nell’asse centrale). La tripla elica è responsabile della natura fibrosa. A seconda del tipo di collagene, la tripla elica può essere continua, o può contenere regioni che danno origine a strutture a conformazione meno ordinata. Questi elementi fungono da regioni cardine e danno maggiore flessibilità.

FIBRE ELASTICHE: Rete nella matrice, possono tenere insieme fibre di collagene. Componente principale è l’ELASTINA (proteina altamente idrofobica, ricca di Pro e Gly, non glicosilata). L’elastina è prodotta a partire da un precursore (TROPOELASTINA) solubile secreto nello spazio extracellulare ed è assemblata in fibre vicino alla membrana plasmatica. Segue la formazione di legami crociati che permette la formazione di una rete.

FIBRONETTINA: Grossa glicoproteina, dimero composto da 2 subunità molto grandi unite da legami disolfuro ad una estremità. Ciascuna subunità è ripiegata in una serie di domini funzionali distinti separati da regioni di catena polipeptidica flessibile. Può dare fibrille.

LAMINE BASALI: Sottili tappeti flessibili di matrice specializzata, sottostanti ai fogli e tubi di cellule epiteliali. Funzione di separazione e filtro (glomerulo); determinano la polarità cellulare, influenzano il metabolismo. Sintetizzata in gran parte dalle cellule che si trovano su di essa; fibrille di ancoraggio composte soprattutto da collagene di tipo IV. Ruolo ISTRUTTIVO nella rigenerazione (giunzione neuromuscolare).

GIUNZIONI CELLULARI: TESSUTO CONNETTIVO: TESSUTO EPITELIALE: Matrice extracellulare abbondante e cellule distribuite in modo sparso al suo interno; è la matrice che sopporta lo stress meccanico. Gli attacchi diretti tra una cellula e l’altra sono rari. Cellule unite strettamente in foglietti chiamati epiteli: matrice extracellulare scarsa, consiste di un tappeto sottile (lamina basale) che sta sotto l’epitelio. L’adesione cellula-cellula sopporta la maggior parte degli stress meccanici. (IMP: contatto tra citoscheletro di cellule adiacenti)

GIUNZIONI CELLULARI: Giunzioni specializzate, si trovano nei punti di contatto cellula- cellula e cellula-matrice. Classificate in 3 gruppi funzionali: 1) g. occludenti: saldano insieme le cellule di un epitelio impedendo il filtraggio di molecole da una parte all’altra dell’epitelio. 2) g. di ancoraggio: attaccano meccanicamente le cellule alle loro vicine o alla matrice. 3) g. comunicanti: mediano il passaggio di segnali chimici o elettrici da una cellula all’altra. classificazione funzionale delle giunzioni g. occludentig. strette g. Settate (invertebrati) g. di ancoraggiog. cellula-cellula g. cellula-matrice g. comunicantig. gap sinapsi chimiche plasmodesmosomi

g. occludenti: g. strette: Permettono agli epiteli di servire da superficie di separazione, non permettono il passaggio di molecole. rete ramificata di filamenti sigillanti che contornano l’estremità apicale di ciascuna cellula del foglietto epiteliale ciascun filamento è composto da una lunga fila di proteine di adesione transmembrana immerse in entrambe le membrane; i domini extracellulari si uniscono tra loro per occludere

Proteine principali: CLAUDINE (di diverso tipo, presenti diversamente nelle giunzioni strette) e OCCLUDINE (funzione incerta, si associano con proteine periferiche intracellulari di membrana chiamate PROTEINE ZO -zona occludens- che ancorano i filamenti al citoscheletro di actina)

g. di ancoraggio: Forte struttura che attraversa la membrana ed è attaccata al citoscheletro. Composte da 2 classi principali di proteine: proteinedi ancoraggio intracellulare (formano una placca sulla superficie citoplasmatica della membrana e connettono il complesso giunzionale o ai filamenti di actina o a filamenti intermedi) proteine di adesione transmembrana (coda citoplasmatica che si attacca a una o + proteine di ancoraggio intracellulari e a un dominio extracellulare che interagisce con domini extracellulari di proteine di adesione transmembrana specifiche su un’altra cellula). Molte giunzioni contengono proteine di segnalazione intracellulare che rendono le giunzioni capaci di segnalare all’interno della cellula.

Le giunzioni aderenti esistono in 2 forme funzionalmente diverse: g. aderenti: caderine + catenine Esistono in varie forme e sono presenti in molti tessuti non epiteliali punti di attacco tondeggianti o a striscia che connettono ndirettamente i filamenti di actina corticali di 2 cellule interagenti formano una “cintura di adesione” sotto le giunzioni strette morfogenesi un fascio contrattile di filamenti di actina si trova adiacente alla cintura orientato in senso parallelo alla membrana (legame actina- membrana tramite proteine come CATENINE, VINCULINA,  -ACTININA)

desmosomi: punti di contatto intracellulare a forma di bottone che ancorano le cellule le une alle altre. Siti di ancoraggio per filamenti intermedi che formano una impalcatura strutturale resistente alla tensione Placca citoplasmatica composta da PLAKOGLOBINA e DESMOPLAKINA, DESMOGLEINA e DESMOCOLLINA.

Adesioni focali: giunzioni cellula-matrice basate su INTEGRINE. rendono le cellule in grado di fare presa sulla matrice (integrine si legano all’interno della cellula a filamenti di actina)

emidesmosomi: si connettono a filamenti intermedi connettono la cellula a una lamina basale (LAMININA) domini extracellulari legano la lamina basale, quelli intracellulari legano i filamenti di cheratina tramite la PLECTINA.

g. comunicanti: costituite da proteine che formano canali (CONNESSINE); i canali formati (CONNESSONI) permettono il passaggio di ioni inorganici e altre piccole molecole solubili in acqua di passare da una cellula all’altra. Le giunzioni gap di tessuti diversi possono aver diverse proprietà (esistono connessine diverse). Sincronizzazione segnali elettrici (contrazione muscolare) Liberazione glucosio (segnale da epatociti innervati a epatociti non innervati) Possono essere regolate (pH, Ca2+) protezione del passaggio di segnali nocivi da una cellula a quelle adiacenti Ex: danno alla membrana, passaggio di ioni all’interno, gli ioni non devono diffondere alle cell vicine, chiusura delle giunzioni gap g. gap:

ADESIONI CELLULA-CELLULA: La motilità cellulare e l’adesione si combinano per far avvenire diversi processi morfogenetici; questi processi possono richiedere un meccanismo che diriga le cellule alla loro destinazione finale (CHEMOTASSI, CHEMOREPULSIONE, o GUIDA DELLA VIA). Una volta che la cellula migrante ha raggiunto la sua destinazione, deve riconoscere altre cellule del tipo appropriato e unirsi a loro per assemblarsi in un tessuto. Le cellule aderiscono tra loro e alla matrice extracellulare tramite proteine di superficie cellulare chiamate MOLECOLE DI ADESIONE CELLULARE (CAM), che possono o meno essere dipendenti dal calcio.

caderine: CAM principale, calcio dipendente. superfamiglia di proteine che comprende caderine classiche e non la maggior parte sono proteine transmembrana a singolo passaggio, possono formare dimeri e oligomeri, a livello extracellulare 5 o 6 ripiegamenti Ig simili

mediano legame OMOFILICO sono unite al citoscheletro di actina da CATENINE (proteine di ancoraggio intracellulari) Fondamentali nel direzionare la morfogenesi, comparsa e scomparsa di alcuni tipi mediano lo sviluppo dell’embrione

selettine: proteine di superficie che legano carboidrati (LETTINE) che mediano una varietà di interazioni transitorie di adesione nel torrente circolatorio, che dipendono dal calcio 3 tipi: L-, P-, E-selettina (linfociti, piastrine, endotelio) proteine transmembrana con dominio di lettina altamente conservato ruolo importante nell’attaccodei globuli bianchi alle cellule endoteliali che rivestono i vasi sanguigni mediano un’adesone debole (rotolamento) Espressione: richiamo vs zone di infiammazione

Super famiglia delle Immunoglobuline: Adesione Ca2+ indipendente N-CAM Derivano da splicing alternativo di un singolo gene Segnali intracell (vd. Src e fosforilazione) Legano lunghe catene di acido sialico Forte carica – Adesione debole Ruolo nella segregazione cellulare

integrine: Ca2+/Mg2+ dip recettori transmembrana principali sulle cellule animali per il legame con la maggior parte delle proteine della matrice extracellulare eterodimeri transmembrana (  e  ) fanno da collegamento tra matrice e citoscheletro connesse a fasci di filamenti di actina tramite subunità b e reclutamento di TALINA  - ACTININA, FILAMINA attività può essere modulata e può attivare vie del segnale

Cells sense multiple environmental signals through their matrix adhesion complexes, mediated via integrin receptors. These adhesions enable cells to behave differently on 2- and 3-dimensional matrices, distinguish between different extracellular matrix (ECM) components, detect differences in adhesive ligand density and respond to mechanical perturbation and surface rigidity. To understand the mechanisms that underlie these diverse responses, Zaidel-Bar and colleagues now provide a detailed description of the in silico integrin adhesome interaction map.adhesome