COLTURA DI CELLULE ANIMALI Conoscenze teoriche di base e tecniche operative (1 a parte) Dott. Adriano Angelucci LTCMA – Aprile 2016

Obiettivi Attraverso l’applicazione di specifiche procedure e tecnologie si occupa: Mantenimento in vitro delle migliori condizioni di sopravvivenza di cellule eucariotiche Permettere la proliferazione delle cellule Preservare da modifiche biologiche le cellule e da contaminazione l’operatore Realizzazione di banche per il mantenimento di campioni cellulari

Alcune tappe della storia 1885 Wihelm Roux: prima coltura di tessuto da embrione di pollo 1907 Ross Granville Harrison & Paul Alfred Weiss: sperimentazione su cellule «in vitro» 1912 Alexis Carrel: metodologie asettiche 1920 Prima banca di cellule (ECACC, European Collection of Cell Cultures) 1965 Leonard Hayflick: limite nel numero di divisioni cellulari 1975 Georges Kohler & Cesar Milstein: primo ibridoma per produrre anticorpi 1998 James Thomson & John Gearhart isolano cellule staminali embrionali umane

Ross Granville Harrison Espianti di tubo neurale di embrioni di rana Coltura in una goccia di linfa di rana contenuta in un vetrino in ambiente sterile Osservazione «in vitro» dello sviluppo nel tempo di fibre nervose

Maggiori conquiste nelle colture cellulari Uso di antibiotici che inibiscono la crescita dei batteri soluzione di streptomicina (10’000ug/ml) e penicillina (10’000U/ml) Uso della tripsina per staccare le cellule dalla piastra di coltura senza danneggiarle tripsina (0,25% )+ EDTA (0,2 mg/ml) Uso di terreni di coltura sintetici

Principali aree di studio Biologia cellulare: sistemi modello per studiare il funzionamento delle cellule Test di tossicità: valutazione preclinica dei farmaci Oncologia sperimentale: carcinogenesi, modelli di progressione tumorale Virologia: ciclo di infezione, produzione di vaccini Terapia cellulare/genetica: modificazione delle cellule a scopo terapeutico

Colture cellulari: pro e contro PRO Riduzione dell’uso di animali da sperimentazione In una linea cellulare le cellule sono omogenee Possibilità di controllare l’ambiente extracellulare Saggiare le cellule senza l’interferenza di altre componenti presenti in vivo CONTRO Le cellule vivono in un ambiente artificiale Comportamento «anomalo» delle cellule rispetto alla situazione in vivo Modello ancora scarsamente predittivo

Colture cellulari: conoscenze di base Caratterizzazione cellulare Requisiti di laboratorio e strumentazione Terreni di coltura Valutazione del rischio e procedure asettiche Banca cellulare e crioconservazione

Caratterizzazione cellulare Coltura primaria: coltura di cellule prelevate da tessuto (pura o mista) Linea cellulare: unico tipo cellulare adattato alla vita in coltura (monoclonale) Linea cellulare continua (stabile): coltura in grado di sopravvivere oltre il limite di Hayflick Trasformata (immortalizzate) Tumorale Ibridoma: fusione di due tipi cellulari caratterizzazione

Preparazione di una coltura primaria caratterizzazione

Morfologia Le cellule in coltura possono crescere adese o in sospensione La morfologia è caratteristica del tessuto di origine caratterizzazione

Morfologia La morfologia è indicatore dello stato della cellula Presenza di contaminazioni caratterizzazione

Mantenimento dei caratteri biologici originari Lo sperimentatore per offrire significato scientifico ai propri risultati deve assicurare che: Il tipo cellulare usato corrisponda agli standard depositati nelle banche cellulari Non sia in alcun modo contaminato Non abbia subito modificazioni biologiche a seguito delle condizioni di coltura caratterizzazione

Colture di cellule adese la densità cellulare deve essere mantenuta all’interno di valori limite per: Mantenere costante il tasso di crescita Evitare la selezione di nuovi cloni La crescita viene valutata come grado di confluenza caratterizzazione

Inibizione da contatto Cellule normali quando vengono a contatto interrompono la loro proliferazione ed entrano in fase G0 Le cellule trasformate e tumorali non risentono dell’inibizione da contatto caratterizzazione

Grado di confluenza Quanta superficie di crescita è occupata dalle cellule Quando le cellule coprono l’80% della superficie vanno spostate (passate) in un nuovo contenitore Se lasciate ad un alto grado di confluenza per troppo tempo le cellule cambiano fenotipo e possono diventare più difficili da staccare Solitamente la crescita esponenziale si ha con valori di densità compresi tra 10 4 e 10 5 cellule per cm 2 caratterizzazione

Colture di cellule adese La linea deve essere mantenuta a crescita esponenziale Conoscenza della superficie di semina Cellule seminate ad una confluenza troppo bassa entrano in uno stato di quiescenza e non proliferano Densità cellulare (10 x ) Numero di cellule caratterizzazione

Numero di passaggi Il numero di volte che la coltura è stata passata («split») in un nuovo recipiente Va sempre indicato sul contenitore Si consiglia di usare le cellule non oltre un certo numero di passaggi per evitare le modificazioni fenotipiche indotte dalla coltura prolungata caratterizzazione

Valutazione del rischio Prevenire danni ad individui ed ambiente Direttive e legislazione europee Il rischio dipende dal tipo di coltura: Basso rischio=linee continue non umane e linee umane diploidi ben caratterizzate Medio rischio=linee poco caratterizzate Alto rischio=colture primarie, linee con patogeni endogeni, linee infettate adeguato contenimento e procedure sempre rispettate procedure

Regole base: cosa fare Usare sempre camice e guanti. Protezioni particolari sono necessarie quando si maneggia l’azoto liquido Pulire tutte le superfici prima di ogni operazione e tra operazioni diverse (o diverso operatore) Identificare in maniera chiara tutti i contenitori che si usano Tenere in ordine e mantenere le superfici di lavoro il più possibile sgombre da oggetti Maneggiare una sola linea cellulare alla volta Controllare i terreni giornalmente per la presenza di contaminazione o di altre alterazioni Rispettare le scadenze di pulizia e di controllo di incubatore e cappa biologica procedure

Protocollo: sottocoltura di cellule aderenti Le cellule smettono di crescere quando raggiungono il 100% di confluenza o in seguito ad esaurimento dei fattori nutritivi Le cellule vanno portate in sospensione Si utilizzano proteasi, soluzioni di proteasi e agenti alchilanti o metodi meccanici procedure

Sottocoltura di cellule adese (1) Accertarsi della confluenza e dello stato delle cellule Rimuovere il terreno Lavare lo strato cellulare con PBS senza Ca2+ e Mg2+ con un volume equivalente a metà volume del terreno usato. Ripetere se le cellule hanno alta capacità adesiva Aggiungere 1ml di tripsina/EDTA ogni 25cm 2 di superficie. Fare in modo che il liquido bagni tutta la superficie Mettere il contenitore in incubatore per 2-10 minuti procedure

Tripsina EDTA La tripsina è un enzima proteolitico che permette il distacco delle cellule dalla piastra di coltura La tripsina taglia i legami peptidici EDTA chela gli ioni calcio nel terreno che inibiscono l’azione della tripsina La tripsina si autodigerisce a 37°C dopo 20 minuti Lasciare le cellule in incubazione con la tripsina ne riduce la vitalità procedure

Osservare le cellule al microscopio per accertarsi che siano in sospensione Agevolare il distacco meccanicamente Diluire le cellule in terreno contenente siero Centrifugare Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un appropriato volume di terreno completo Contare le cellule Prelevare il volume contenente il numero di cellule necessario procedure Sottocoltura di cellule adese (2)

Punti cruciali Diversi tipi cellulari hanno capacità adesive molto diverse La presenza di EDTA aiuta il distacco delle cellule L’eliminazione di siero è fondamentale per aumentare l’efficacia della tripsina L’esposizione prolungata a tripsina può danneggiare irreversibilmente le cellule La fase di centrifugazione può essere omessa se si usano elevate quantità di siero La tripsina danneggia le proteine di superficie procedure

Procedura di conta Centrifugare Risospendere in un piccolo volume di terreno completo Prelevare 100  l di sospensione Aggiungere un ugual volume di Trypan Blue (0,4%) Riempire le camere del vetrino (5-10  l) Osservare al microscopio ad ingrandimento 20x Calcolare il numero di cellule secondo le specifiche del vetrino di conta (dimensioni del reticolo) procedure

Trypan Blue Colorazione per esclusione Le cellule vive non assorbono il colorante Le cellule morte con membrana rotta assorbono il colorante e si colorano di blu procedure

Camere di conta (emocitometri) Vetrini speciali che presentano una griglia microscopica che serve per contare le cellule procedure

Calcolo del numero di cellule A= media delle cellule vive B= media delle cellule morte C= fattore di diluizione D= fattore di conversione in ml Concentrazione cellule vive= A*C*D Concentrazione cellule morte=B*C*D Volume della conta= 0,1x 1 mm 2 =0,1 mm 3 Fattore di conversione= 10 4 (0,1 mm 3 =0,1ul= ml) procedure

Punti cruciali Un’adeguata accuratezza della misura si ottiene contando almeno 100 cellule Il Trypan blue è tossico ed è un potenziale carcinogeno Le cellule devono essere ben distinte e uniformemente distribuite Evitare la presenza di bolle e detriti Non riempire eccessivamente la camera Se le cellule sono poche, operare una nuova centrifugazione e risospendere in meno terrreno procedure

Calcolo della vitalità cellulare Colorazione con Trypan Blue Le cellule vive sono impermeabili al Trypan Blue mentre le cellule morte assorbono il colorante Mescolare trypan blue con un’aliquota delle cellule da valutare Conta alla camera di conta per stabile il numero di cellule vive (Nv) e il numero di cellule morte (Nm) % di vitalità = (Nv X 100)/(Nv+Nm) procedure

Adesione cellulare ancoraggio migrazione – “homing” comunicazione - anoikis caratterizzazione

Tipologie di migrazione Chemotassi: movimento guidato da un fattore solubile Aptotassi: movimento guidato da sostanze presenti nella matrice extracellulare non diffusibili Chemotropismo: crescita (senza movimento) dei tessuti verso una sostanza attraente caratterizzazione

Test di adesione Valutazione della capacità delle cellule di aderire su un substrato fisiologico (collagene, fibronectina, laminina…) Cerca di riprodurre le condizioni in vivo La crescita su matrici biologiche modifica la morfologia e la capacità di crescita delle cellule La presenza di proteine di matrice può stimolare la migrazione L’adesione può essere un bersaglio farmacologico per impedire la diffusione del tumore

Esperienza di laboratorio Finalità: Valutare la capacità adesiva di fibroblasti a diversa densità Materiale di partenza: Piastre rivestite con collagene (6 pozzetti di piastra multipozzetto) Piastra di cellule umane adese Tripsina/EDTA Tampone fosfato Albumina bovina sierica Soluzione di trypan blue Crystal violetto Formaldeide