TOLLERANZA AL LATTOSIO Alimentazione e evoluzione

Outline Che cos’è il lattosio Che cos’è la lattasi Traduzione e processamento dell'enzima lattasi Regolazione del gene della lattasi (LCT) Che cos’è la tolleranza al lattosio e test diagnostici Evoluzione della tolleranza al lattosio Basi genetiche della tolleranza al lattosio L'allele T-13910 T-13910 in Italia La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente La complessa storia della persistenza della lattasi in Africa Il gene dell’amilasi (AMY1)

Che cos’è il lattosio? Il lattosio è il principale disaccaride presente nel latte È formato da un’unità di glucosio e una di galattosio Galattosio Glucosio

Che cos’è il lattosio? cammello 4 mucca 5 cavallo 6 uomo 7 Dairy Products Calcium Content Lactose Content Yogurt, plain, low-fat, 1 cup 415 mg \\5 g Milk, reduced fat, 1 cup 295 mg 11 g Swiss cheese, 1 oz 270 mg \\1 g

Che cos’è la lattasi? LATTASI (LPH) Il lattosio viene idrolizzato nei sue due monosaccaridi (Galattosio e Glucosio) dall’enzima Lattasi Florizin-idrolasi (LPH) Galattosio Glucosio Circolo sanguigno

Che cos’è la lattasi? L’enzima viene sintetizzato dalle cellule epiteliali intestinali processato nel reticolo endoplasmatico e nell’apparato di Golgi Enzima maturo Troelsen et al.(2005)

Che cos’è la lattasi? Cellula epiteliale intestinale Troelsen et al.(2005)

Traduzione e processamento della lattasi Traduzione dell’mRNA e traslocazione sul reticolo endoplasmatico Rescissione del peptide segnale N-terminale (c) N-glicosilazione (d) Formazione degli omodimeri. Reticolo endoplasmatico Troelsen et al.(2005)

Traduzione e processamento della lattasi II trasloco nell’apparato di Golgi (e) O-Glicosilazione. (f) Rescissione del Pro-LPH. Troelsen et al.(2005)

Traduzione e processamento della lattasi Trasloco sulla membrana microvillica Troelsen et al.(2005)

Regolazione del gene LCT Il gene della lattasi florizin idrolasi (LCT) mappa su 2q21 La sua attività è regolata da un promotore subito a monte del primo esone del gene

Regolazione del gene LCT GATA CE-1a Regione altamente conservata

Regolazione del gene LCT HNF 1a GATA 4 CDX 2 + Enhancer GA 2c GA 1a 150 bp ~14000 bp

Regolazione del gene LCT Promotore distale attività enhancer (introne 13 gene MCM6) OCT-1 AAGATAATGTAGCC

Che cos’è la tolleranza al lattosio? PERSISTENZA DELLA LATTASI ~ 30% Homo sapiens Attività del LPH Mammiferi ~ 70% Homo sapiens N S Time N= Nascita S= Svezzamento

Che cos’è la tolleranza al lattosio? Assenza di lattasi Nessun legame col l’enzima (LPH) durante il transito intestinale Il lattosio arriva indisturbato nell’intestino Fermentazione da parte della flora batterica intestinale Formazione di gas (metano, CO2, H2) Presenza di lattasi Legame del dimero all’enzima (LPH) durante il transito intestinale Idrolisi in glucosio e galattosio Immissione del glucosio e del galattosio nel circolo sanguigno quindi nel fegato

Test diagnostici Misura la variazione di idrogeno dopo l’assunzione di circa 50g di lattosio -10 20 50 80 110 140 170 200 230 BH2 parti per milione  Test bioptico Test del glucosio H2 breath test BH2 > 20 ppm INTOLLERANTI BH2 < 20 ppm TOLLERANTI

Evoluzione della tolleranza al lattosio La distribuzione del fenotipo persistente mostra alte frequenze nella regione della penisola Arabica e in Europa, in particolare nelle regioni settentrionali Itan et al. 2009

Evoluzione della tolleranza al lattosio B A) Distribuzione del fenotipo tollerante al lattosio B) Localizzazione dei siti Neolitici che mostrano presenza di attività di allevamento di bovini

Evoluzione della tolleranza al lattosio Adozione della pastorizia Insorgenza della mutazione Aumento in frequenza della mutazione dovuta alla selezione naturale * Cultural-historical Simoons 1969 Insorgenza della mutazione Adozione della pastorizia Aumento in frequenza della mutazione dovuta alla selezione naturale * Reverse cause Bayless 1971 Partendo dall’osservazione che la distribuzione del fenotipo persistente e la distribuzione della cultura pastorale erano compatibili E. Simoons formulò, la C.H.H. , sull’evoluzione del tratto persistente. Questa teoria implica un meccanismo di coevoluzione gene-cultura in qui il cambiamento dell’ambiente culturale, in questo caso l’instaurarsi di un’economia di sussistenza basata sulla pastorizia fa si che il tratto persistente assuma un valore adattativo e aumenti in frequenza. Per la Simoons il vantaggio derivante dalla capacità di utilizzare latte fresco era il valore nutritivo del latte stesso ed in particolare durante lunghi periodi di carestia. Sulla base di questa teoria, la arid climate hypothesis individua nel latte una fonte di cibo e liquido incontaminato per le popolazioni che vivono in zone desertiche, mentre la Calcium absorption hypothesis pone l’accento sul contenuto di calcio nel latte il quale eviterebbe il rachitismo e l’osteomalachia frequenti nelle alte latitudini a causa della scarsa irradiazione solare. * : LP individual

Evoluzione della tolleranza al lattosio Arid climate hypothesis Cook & al-Torki 1975 Il latte come fonte di cibo e fluidi incontaminati nei climi desertici Calcium absorption hypothesis Flatz & Rotthauwe 1973 Il latte come fonte di calcio e vitamina D per la riduzione del rischio di insorgenza del rachitismo nelle latitudini con scarsa irradiazione solare

Evoluzione della tolleranza al lattosio Neolitico NEOLItico? Il Neolitico inizia circa 11000 anni fa nella regione della mezzaluna fertile Cambiamenti climatici dovuti alla fine del LGM hanno permesso la diffusione dell'agricoltura al di fuori della Mezzaluna fertile Le prime evidenze di attività agricola in Europa sono state trovate a Cipro, Creta e Grecia continentale circa 9000 anni fa (Price 2000)

Basi genetiche della tolleranza al lattosio Studi su famiglie hanno dimostrato che la tolleranza al lattosio è un tratto ereditabile e che quindi è geneticamente determinato. Il fenotipo tollerante era ereditato come un singolo gene autosomico dominante (Bayless e Rosensweig 1966) AA: fenotipo intollerante Aa: fenotipo tollerante aa: fenotipo tollerante A= gene non mutato a= gene mutato

Basi genetiche della tolleranza al lattosio Cromosoma 2 regione q21.3 C/T -13910 100% G/A -22018 97% Enattah et al. 2002

Oct-1 DNA binding protein Basi genetiche della tolleranza al lattosio Low transcription C-13910 lact mcm6 C Oct-1 DNA binding protein + High transcription T lact mcm6 T-13910

Distribuzione dell’allele T-13910 Itan et al. 2009

Distribuzione dell’allele T-13910 Nord Ovest Sud Est Itan et al. 2009

Età e origine dell’allele T-13910 Nel 2007 uno studio estensivo su 37 popolazioni a livello mondiale (9 SNPs intorno al polimorfismo C/T-13910) ha stimato l’età e l’origine della variante T-13910 Enatah et al, 2007

Età e origine dell’allele T-13910 DEFINIZIONI UTILI Aplotipo Combinazione di varianti alleliche lungo un cromosoma o segmento cromosomico contenente loci strettamente associati tra loro ATTTCCCCTAGGTAGA ATTTGCACTAGGCAGA Aplotipo 2 ATTTCCCCTAGGTAGA ATTTCCCCTAGGTAGA Aplotipo 1 ATTTGCACTAGGCAGA

Età e origine dell’allele T-13910 Filogenia: Struttura ad albero che rappresenta le relazioni evolutive tra un insieme di taxa (dove per taxon si intende un’unità evolutiva, quindi dall’aplotipo… alla specie!)

Età e origine dell’allele T-13910 ANCESTORE COMUNE La filogenia fornisce una dimensione temporale ed evolutiva AAAGGTACC G  T mutation AAATGTACC A  G mutation AAATGTACC AAATGTGCC A  T mutation AAATGTGCC TAATGTGCC

Età e origine dell’allele T-13910 The Molecular Clock Hypothesis L’ammontare della variazione genetica tra sequenze (o aplotipi) è in funzione del tempo di divergenza Il tasso dei cambiamenti molecolari è costante (abbastanza) da permettere di predire i tempi di divergenza

Età e origine dell’allele T-13910 In realtà si misura il momento in cui intorno alla variante inizia a formarsi della variabilità N=5 N=2 N=1 AAAGGTACT AGAGGTACT Mutazione A  G Mutazione C  T Tasso di mutazione/anno=10-3 AAAGGTACC Mutazione A  G Una mutazione ogni 1000 anni Mutazione A  T AAAGGTGCC AAAGGTACC 4000 anni TAAGGTACC

Età e origine dell’allele T-13910 La variante T-13910 sarebbe comparsa 2 volte in tempi diversi nella medesima regione geografica 1400 - 3000 5000 - 12000

Età e origine dell’allele T-13910 In tutte le popolazioni analizzate l’età della variante T-13910 è risultata molto recente (età max ~10000 anni fa) Risultato compatibile con la “Cultural Historical hypothesis” e con l’avvento della pastorizia

Età e origine dell’allele T-13910 Zona degli Urali e del Caucaso settentrionale

Selezione positiva dell’allele T-13910 Aplotipi più lunghi intorno alla variante T-13910, aplotipi più corti intorno alle varianti C-13910 La frequenza cresce velocemente e non lascia il tempo alla ricombinazione di spezzare gli aplotipi

Selezione positiva dell’allele T-13910 C-13910

T-13910 in Italia 865 samples ; 19 populations; 5 macroregions North-Eastern Italy 219 Ladini (Bolzano) 30 Val di Scalve (Bergamo) 102 Udine 53 Castelmassa (Rovigo) 34 865 samples ; 19 populations; 5 macroregions Central-Northern Italy 206 Bologna 95 Palazzuolo (Firenze) 33 Alfero (Forlì-Cesena) 41 Alta val Savio (Forlì-Cesena) 37 Central Italy 96 Tocco da Casauria (Pescara) 38 Roma 30 Norma (Latina) Southern Italy 189 Benevento 30 Albidona (Cosenza) 52 Messapi (Brindisi) 23 Roseto Capo Spulico (Cosenza) 27 Belvedere Marittimi (Cosenza) 28 Siracusa 29 Sardinia 153 Gallura 37 Fonni (Nuoro) 116 Anagnostou et al. 2009

T-13910 in Italia SNPs Microsatelliti

T-13910 in Italia Si definiscono microsatelliti sequenze costituite da unità di ripetizione molto corte (1-5 bp) disposte secondo una ripetizione in tandem GATA Unità di ripetizione 7 ripetizioni ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC 6 ripetizioni ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC 8 ripetizioni ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC Evoluzione estremamente veloce (10-3 - 10-4)

T-13910 in Italia La distribuzione delle frequenze della variante T-13910 in Italia non mostra un andamento clinale omogeneo, piuttosto viene evidenziata una diversità tra il Nordest ed il resto del paese

T-13910 in Italia Datazione basata sulla simulazione del declino, nel tempo, dell’allele originariamente associato alla mutazione in ognuno dei loci STR.

T-13910 in Italia MACROREGIONI Età della mutazione Sardegna 4303 (2369-6923) Italia Nord-orientale 7658 (5837-10227) Italia centro-settentrionale 7512 (5124-11803) Italia centrale 6881 (4421-10343) Italia meridionale 7522 (4653-11794) ITALIA CONTINENTALE 7349 (6227-8670)

T-13910 in Italia Test di selezione che valuta se la frequenza osservata di un allele è compatibile con il suo livello di variabilità, considerando un determinato modello demografico ed assumendo una condizione di neutralità. Allele 1 p1=p2=10% Allele 2

T-13910 in Italia Test di selezione hanno evidenziato segnali più intensi per le regioni del Nord-est Diverso utilizzo del latte Uso prevalente di latte fresco nel Nord-est (più lattosio) Uso prevalente dei derivati nel resto del paese (meno lattosio)

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Frequenza dell’allele T-13910

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Tolleranza al lattosio (dato fisiologico)

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente

LCT-promoter region 2.0kb La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente 136261885] LCT 49.3 kb 3’ Centromere Telomere UBXD2 LOC391448 DARS [136215806 [136459692 5’ MCM6 36.2 kb 136350481] ~ 3.1 kb LCT-promoter region 2.0kb Intron 13 3.2 kb …GT C/G CC C/T GATG T/G AATAGAA.………ACCATTGAAT G/C C… -13907 bp -13910 bp -13915 bp -14010 bp Varianti Africane

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente 819 individui di 63 popolazioni Africane 154 individui di 9 popolazioni Europee, mediorientali e Asiatiche Sequenziamento degli introni 9 e 13 del gene MCM6 e il promotore prossimale del gene LPH 4 microsatelliti su 252 individui Africani Test di tolleranza al lattosio su 513 individui dell’Africa orientale (Tanzania, Sudan e Kenya)

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Variante G-13915

Popolazioni di pastori di lingua Afroasiatica La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Variante G-13907 Language Sudan P/G LP LIP LNP G-13907 % Afro-asiatic 17/17 15 2 20.6 Nilo-Saharian 26 14 8 4 0.0 Totale 43/44 29 6 8.0 Language Kenya P/G LP LIP LNP G-13907 % Afro-asiatic 64/64 36 15 13 4.8 Nilo-Saharian 126/128 63 28 35 1.2 Niger- Kordofanian 2/2 1 0,0 Totale 192/194 100 43 49 2.4 Popolazioni di pastori di lingua Afroasiatica Beja Banuamir 25% Beja Hadandawa 18,2%

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Variante G-14010 Language Tanzania P/G LP LIP LNP C-14010 % Nilo-Saharian 45/47 20 12 13 39.4 Niger- Kordofanian 61/61 27 17 23.0 Khoisan 48/49 10 21 8.3 Afro-Asiatic 81/99 35 16 30 45.8 Totale 235/256 99 55 81 31.9 Language Kenya P/G LP LIP LNP C-14010 % Afro-asiatic 64/64 36 15 13 18.3 Nilo-Saharian 126/128 63 28 35 31.5 Niger- Kordofanian 2/2 1 75.0 Totale 192/194 100 43 49 27.6

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente EHH extended haplotype homozygosity C-14010 Kenya Lingua Nilo-sahariana Kenya Lingua Afroasiatica Tanzania Sandawe

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Variante G-13907 Kenya Lingua Afroasiatica Sudan Lingua Afroasiatica

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente Variante G-13915 Sudan Lingua Afroasiatica Kenya Lingua Afroasiatica

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente ANALISI FENOTIPO - GENOTIPO Associazione significativa per le varianti C – 14010 G – 13915 G – 13907 Associazione significativa per le varianti G – 12926 T – 956 In forte linkage con le varianti C – 14010 e G - 13915 Singolarmente spiegano ognuna non più del 21% della varianza fenotipica Insieme spiegano il 45% della varianza fenotipica

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente KENYA

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente TANZANIA

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente SUDAN

La persistenza della lattasi: un esempio di adattamento convergente CAUSE DELLA DISCREPANZA Errore intrinseco dei test fisiologici non invasivi Fattori fisiologici che generano falsi positivi e negativi (flora batterica intestinale che non produce idrogeno; velocità elevata di transito attraverso il tratto gastrointestinale, celiachia, infezioni gastrointestinali) Presenza di altre varianti associate alla persistenza della lattasi non ancora identificate

La complessa storia della persistenza della lattasi in Africa Alta frequenza nella penisola Arabica che suggerirebbe una sua origine in quella regione geografica Origine circa 4000 anni fa come risposta alla domesticazione del cammello Introduzione in Africa orientale circa 1400 anni fa in seguito all’espansione Araba che ha accompagnato la diffusione della religione islamica

La complessa storia della persistenza della lattasi in Africa Frequenza maggiore tra le popolazioni di lingua Afroasiatica dell’Etiopia, Sudan settentrionale e Kenya settentrionale Totalmente assente nelle altre regioni dell’Africa orientale Probabilmente originatasi nell’Etiopia orientale, tra le popolazioni di pastori di lingua Cushit che sono migrati in Sudan e Kenya circa 5000 anni fa

La complessa storia della persistenza della lattasi in Africa Presenza in Tanzania, Kenya e, a frequenze basse in Africa meridionale L’età della variante è stata stimata tra i 2700 e i 6500 anni Osservazioni in accordo con dati archeologici che pongono la diffusione delle pratiche pastorali in queste zone tra i 4500 e i 3300 anni fa (in seguito alle migrazioni di popolazioni di pastori dal Nord Africa) Origine probabilmente in Tanzania (popolazioni di lingua Cushit) e successiva diffusione

Non è ancora finita Distribuzione della tolleranza al lattosio inferita dalla frequenza di tutte e 4 le varianti Itan et al., 2010

Non è ancora finita Itan et al., 2010

Il gene dell’amilasi (AMY1) Scinde l’amido in zuccheri semplici Prodotta dalle ghiandole salivari e dal pancreas Il gene che codifica per l’enzima (pos.1q21) è presente in numero di copie variabili negli individui Esistono pattern nel numero di copie di AMY1?Esiste una correlazione con l’espressione genica?E con la dieta?

Il gene dell’amilasi (AMY1) Variazioni nel numero di ripetizione del gene AMY1 (a) Giapponese (b) Pigmeo Biaka (c) Scimpanzè

Il gene dell’amilasi (AMY1) Agricoltori Cacciatori/raccoglitori

Il gene dell’amilasi (AMY1) Esiste,nelle diverse popolazioni una correlazione tra il numero di copie del gene AMY1 e la dieta (differenze tra cacciatori- raccoglitori e produttori di cibo) Confrontando la differenza nucleotidica esistente tra scimpanzè- uomo (d=0,027 6MYA) e tra le differenti popolazioni (0,00011<d<0,00056) si stima che la variabilità nel numero di ripetizione di AMY1 sia relativamente recente.