Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e quantificazione dei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissime applicazioni in campo alimentare. Nei metodi cromatografici i componenti di una miscela si separano distribuendosi tra due fasi: una fase stazionaria (un solido o un liquido su supporto solido inerte) una fase mobile (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su quella stazionaria. La separazione è dovuta principalmente alle relative affinità per la fase stazionaria. Nella cromatografia liquida (LC) la fase mobile è un liquido, nella gas cromatografia (GC) la fase mobile è un gas. 28

CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI 29

Quale componente ha K maggiore? PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una colonna chiusa. La fase stazionaria consiste di particelle solide porose contenute all’interno di un tubo lungo e sottile (colonna). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m): Xm  Xs Il coefficiente di ripartizione (o di distribuzione) del componente X è definito come: Quale componente ha K maggiore? A: il campione viene iniettato all’entrata della colonna B  D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria A B C D Flusso del solvente p. 518 30

tR tM p. 521 Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dall’inizio all’uscita della colonna. Tempo morto (tM): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile lungo la colonna. Analogamente si definiscono i corrispondenti: Volume di ritenzione (VR): volume di fase mobile necessario ad eluire l’analita dall’inizio all’uscita della colonna. Volume morto (VM): il volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto (corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna). 31

Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocità di migrazione dell’analita lungo la colonna è il fattore di capacità, k’. Si dimostra che k’ può essere ricavato dai parametri del cromatogramma: Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k’. La selettività quantifica l’entità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (tR)B> (tR)A. 32

Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilo Gaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la velocità media. I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono: diffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore concentrazione a quella a minore in direzione parallela all’asse della colonna); percorsi multipli; trasferimento di massa tra fase mobile e fase stazionaria. 33

Parametri che descrivono quantitativamente l’efficienza di una colonna (ampiezza dei picchi): Altezza equivalente di piatto teorico H Numero di piatti teorici N L = lunghezza colonna Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola separazione, N ha un significato puramente matematico. Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna. Si può dimostrare che W = larghezza del picco W L’altezza equivalente al piatto teorico (H = L/N) consente di confrontare l’efficienza di colonne di differente lunghezza. 34

Variabili che influenzano l’efficienza di una colonna: La principale variabile che influenza l’efficienza di una colonna è la velocità di flusso lineare (cm/s) della fase mobile. Questa infatti influenza il tempo di contatto tra fase mobile e fase stazionaria. L’altezza equivalente del piatto teorico, H, il parametro che descrive l’efficienza della colonna, dipende proprio dalla velocità di flusso della fase mobile (vedere Figura a lato). Sia in LC che in GC la velocità di flusso ottimale è piuttosto bassa. Quella ottimale della LC è inferiore a quella ottimale della GC. Per evitare tempi di analisi troppo elevati, in LC si usano velocità un po’ maggiori di quella ottimale. La LC è caratterizzata da valori di H inferiori alla GC. In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: > 50 m; LC: < 50 cm), la GC è comunque caratterizzata da valori più elevati di N, e quindi da migliore efficienza. 35

La risoluzione, R, è una misura quantitativa della capacità di separare due analiti. Essa è ricavabile dal cromatogramma: p. 530 Vedere Figura 26-10 La risoluzione caratterizza la bontà di separazione fra due picchi sia con riferimento alla differenza fra i tempi di ritenzione (numeratore) sia riguardo all’efficienza di separazione (denominatore). Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza (picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una buona differenziazione del comportamento dei soluti (selettività)  vedere equazione successiva. 36

Si può dimostrare che: Effetto della selettività, dell’efficienza e del fattore di capacità sulla risoluzione risoluzione scarsa picchi non separati buona risoluzione dovuta a buona efficienza picchi stretti buona risoluzione dovuta a buona selettività picchi distanti risoluzione scarsa dovuta ad un basso fattore di capacità 37

Le applicazioni della cromatografia vanno dall’analisi qualitativa a quella quantitativa di miscele anche molto complesse. L’analisi quantitativa sfrutta la misurazione dell’altezza o dell’area dei picchi. La misurazione dell’area è più affidabile in quanto non risente dell’eventuale allargamento dei picchi in seguito a variazione delle condizioni di lavoro. I metodi di analisi sono tutti indiretti. Si costruisce prima una curva di calibrazione per ciascun analita e poi si ricava la concentrazione dell’analita nella miscela in esame mediante interpolazione. Il metodo dello standard interno è il più affidabile: una quantità nota di standard viene introdotta nelle soluzioni standard e nel campione in esame; il parametro analitico è quindi costituito dal rapporto tra le aree dello standard e dell’analita (il metodo funziona solo se il picco dello standard è vicino ma separato da quello dell’analita). 38

Cromatografia per Scambio Ionico Nella cromatografia per scambio ionico, la ritenzione si basa sull’attrazione tra gli ioni del soluto e i siti carichi legati alla fase stazionaria. La fase stazionaria è costituita da una resina a scambio ionico, ossia un supporto organico al quale sono legati dei gruppi ionici o ionizzabili (ad esempio –SO3-, -COO-, -NR3+). I gruppi ionici della resina trattengono per mezzo di interazioni elettrostatiche, controioni di carica opposta che possono essere scambiati con gli ioni presenti nella fase mobile. Il meccanismo di separazione è basato perciò sulla diversa affinità che i diversi soluti (ionici) presentano nei confronti dei gruppi attivi della resina.

Cromatografia Ionica È la variante ad alta pressione (prestazioni) della cromatografia per scambio ionico Serve per separare e quantificare ioni, in particolare inorganici, utilizzando resine a scambio ionico

Rivelatore a Conducibilità Il cromatografo ionico è sostanzialmente un HPLC ed è composto da: Riserva di eluente Pompa tipo HPLC Soppressore Integratore Valvola Iniezione Colonna Rivelatore a Conducibilità

Colonne Forti Deboli Sono il cuore dello strumento. La separazione avviene per una serie di equilibri di scambio tra fase stazionaria e fase mobile (eluente) Gli ioni con carica netta più elevata (al pH dell’eluente) vengono trattenuti più fortemente A parità di carica vi è un ordine di selettività che dipende dal tipo di fase stazionaria (dipende dalle costanti di scambio) Forti Deboli

In generale le resine a scambio ionico e complessanti sono costituite da un reticolo irregolare tridimensionale di catene di natura organica unite tra loro da legami incrociati. Su questa matrice sono fissati dei raggruppamenti ionici (quali –SO3-, -COO-, -NR3+) in grado di interagire con uno ione metallico o per semplice scambio ionico o mediante formazione di legami di coordinazione (resine complessanti o chelanti). solitamente uno scheletro polistirenico ottenuto per copolimerizzazione dello stirene con il divinilbenzene. Il contenuto di divinilbenzene può variare dall’ 1 al 16% e determina il grado di reticolazione (cross-linking). Lo scambiatore si dice cationico quando contiene delle cariche negative e i cationi sono attratti elettrostaticamente da questi siti di carica opposta. Lo scambiatore si dice anionico quando contiene dei gruppi carichi positivamente in grado cioè di legare degli ioni di carica negativa. Gli anelli benzenici possono venire modificati per produrre una resina a scambio cationico contente gruppi solfonato (-SO3-) oppure una resina anionica contenente gruppi ammonici (-NR3+). Se al posto dello stirene si usa acido metacrilico si ottiene una resina con gruppi attivi carbossilici e scheletro acrilico divinilbenzenico (-COO-).

Ampio intervallo di pH di utilizzo Tipi di Resine Ampio intervallo di pH di utilizzo Cationico Anionico Forte -SO3- H+ -N+(CH3)3 OH- Debole -COO- H+ -N+H3 OH- La comune definizione delle resine ioniche è fatte sulla base della acidità del loro gruppo attivo Ridotto intervallo di pH di utilizzo

Il grado di reticolazione nelle resine a scambio ionico è variabile ed è scelto in funzione delle caratteristiche che deve presentare lo scambiatore. Resine con alto grado di reticolazione sono rigide e poco porose, lente nel raggiungere l’equilibrio, anche se la selettività e la capacità sono maggiori, rispetto alle resine con basso grado di reticolazione (dette anche macroporose) sono più veloci ad equilibrarsi, ma che si rigonfiano d’acqua. L’affinità maggiore per la fase resina è per ioni: a carica elevata, a piccolo raggio di idratazione, molto polarizzabili (polarizzabilità è capacità della nuvola elettronica di uno ione a venire deformata da cariche vicine e a formare un dipolo).

Diffusione molto veloce ma capacità ridotta I difetti dei polimeri PS/DVB sono: Microporosità della matrice con conseguente lenta diffusione dell’analita nel loro interno Compressibilità Tendenza al rigonfiamento al cambio di eluente Attualmente si utilizzano: Granuli Pellicolari, particelle di vetro non poroso (o polimero) ricoperte di un sottile strato di scambiatore Microparticelle di Silice porosa ricoperte con una sottile pellicola di scambiatore, più economiche Diffusione molto veloce ma capacità ridotta

Equilibri di Scambio Ionico In generale le specie che presentano più cariche tenderanno a legarsi più fortemente alla resina È necessario l’impiego di uno ione competitore perché gli analiti vengano rilasciati: ELUENTE

Un Tipico Esperimento

Eluente La fase eluente deve contenere elettroliti forti, composti ionici completamente dissociati, in grado di competere con gli analiti nello scambio con la resina. Gli analiti vengono eluiti più velocemente quanto più è alta la concentrazione di competitori. Può contenere solventi organici (CH3CN, MeOH, ecc.) per evitare l’adsorbimento per interazione idrofobica su resina o gruppi funzionali di analiti organici Se rimane costante durante tutta l’analisi -> Eluizione Isocratica Se cambia di composizione durante l’analisi -> Gradiente di Eluizione Forza Ionica pH Concentrazione dei costituenti Il gradiente si può comporre: sotto pressione con una pompa per ogni componente (più riproducibile ma strumentazione più costosa) non sotto pressione con l’ausilio di un miscelatore posto prima della pompa

Come è possibile ovviare al problema? Rivelatore Dato che si determinano ioni, il rivelatore universalmente utilizzato è costituito da una piccola cella conduttimetrica. Applicando una piccola ddp tra i due elettrodi, fluisce una corrente proporzionale alla conducibilità dell’eluente + analita. Problema: poiché i rivelatori a conducibilità rispondono a tutti gli ioni e l’eluente è costituito da una soluzione elettrolitica concentrata, il suo segnale coprirebbe quello degli analiti. Come è possibile ovviare al problema?

La conducibilità dell’eluente viene eliminata mediante un Soppressore L’unità di soppressione può essere costituita da: Cartucce usa e getta Micromembrana rigenerata controcorrente Micromembrana rigenerata elettroliticamente Il soppressore è uno scambiatore di ioni di segno opposto rispetto agli analiti ed ha lo scopo di diminuire il segnale di fondo dato dagli ioni contenuti nell’eluente.

Integrazione e quantificazione Il rivelatore produce un segnale elettrico analogico (E) che viene digitalizzato e “contato” tramite un integratore (o un interfaccia A/D e un computer). L’area dei picchi del cromatogramma è proporzionale alla concentrazione dell’analita rendendo possibile la quantificazione.

Esempi Separazione di Anioni es. Cl-, NO3- e SO42- La configurazione dello strumento è: colonna con resine ammonio quaternario in forma HCO3-; soppressore in forma H+; rivelatore conduttimetrico. Gli analiti in esame sono dissociati a qualsiasi pH quindi scegliamo come eluente una miscela Na2CO3/NaHCO3 Nella colonna gli anioni si separano ed escono a diversi tempi in forma Na+ (Na+Cl-,…) insieme ad un largo eccesso di Na+HCO3- e Na+2CO32- Tutti gli analiti, trasformati in acidi forti, (H+Cl-,…) danno un segnale mentre l’eluente, ora H2CO3 poco dissociato, non viene rivelato Nel soppressore il catione coordinato (Na+) viene sostituito da H+.

Esempi Separazione di Cationi es. Na+, K+ e NH4+ La configurazione dello strumento è: colonna con resine solfoniche in forma H+; soppressore in forma OH-; rivelatore conduttimetrico. In questo caso l’eluente è HCl Nella colonna i cationi competono con H+ e si separano. Escono coordinati a Cl- (Na+Cl-,…) insieme ad un largo eccesso di H+Cl- Tutti gli analiti, trasformati in idrossidi dissociati, (Na+OH-,…) danno un segnale Nel soppressore l’anione coordinato (Cl-) viene sostituito da OH- e l’eccesso di H+ viene neutralizzato ad H2O.

Se l’analisi riguarda la quantificazione di cationi, o anioni, in un acqua di scarico, potrebbe convenire ricorrere alla cromatografia ionica. 63

GASCROMATOGRAFIA La fase mobile è un gas. Le sostanze da separare (liquidi, solidi, gas) devono essere portate ad una temperatura sufficiente a renderle gassose o comunque portarle allo stato di vapore. Cromatografia di adsorbimento gas-solido (fase stazionaria = solido adsorbente) Cromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria = liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti della colonna) A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: il gas di trasporto serve solo per trascinare i componenti lungo la colonna.

SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO He, Ar, N2, H2 67

Iniezione ed iniettori Il campione viene iniettato in quantità molto piccole (fino a 0,5 ml per impaccate, fino a 100 volte inf. per capillari). L’entrata deve essere ad una temperatura sufficientemente elevata da permettere l’evaporazione istantanea del campione e abbastanza grande da permettere al vapore di espandersi senza essere spinto indietro. Colonne gascromatografiche Si suddividono in impaccate e capillari. Le impaccate contengono particelle solide che vengono impaccate: diatomee o diatomee silanizzate, per ridurre la polarità mediante arricchimento superficiale di gruppi metilici. Le capillari sono tubi molto più sottili e lunghi (diametro = 0.3-0.5 mm; lunghezza = 50-300 m) in cui la fase stazionaria è depositata sulle pareti interne. Queste ultime hanno un elevato numero di piatti teorici (anche 300.000) grazie alla loro elevata lunghezza. 68

Colonna capillare standard a fase legata 69

45° 145° Influenza della T sui tR: programma di T più la temperatura è elevata più il soluto tende a trasferirsi nella fase gassosa  aumentando T diminuisce tR 145° programma di T 70

Function Separation of volatile organic compounds Volatile – when heated, VOCs undergo a phase transition into intact gas-phase species Separation occurs as a result of unique equilibria established between the solutes and the stationary phase (the GC column) An inert carrier gas carries the solutes through the column

Components Carrier Gas, N2 or He, 1-2 mL/min Injector Oven Column Detector

Injector Syringe Detector Gas tank Column Oven

Splitless (100:90) vs. Split (100:1) Injector Syringe Purge valve open closed He He GC column GC column

Split or splitless Usually operated in split mode unless sample limited Chromatographic resolution depends upon the width of the sample plug In splitless mode the purge valve is close for 30-60 s, which means the sample plug is 30-60 seconds As we will see, refocusing to a more narrow sample plug is possible with temperature programming

Open Tubular Capillary Column 0.32 mm ID Mobile phase (Helium) flowing at 1 mL/min Liquid Stationary phase 0.1-5 mm 15-60 m in length

Who Discovered SPME? Solid Phase Microextraction was invented in 1990 by Dr. Janusz Pawliszyn and his colleagues from the University of Waterloo in Canada. He invented this technique to “address the need for a fast, solvent-free, and field compatible sample preparation method”, which faster and more efficient is the name of the game in industry.

What is an SPME? SPME, also known as “Spee Mee”, is a solvent-free adsorption/desorption technique. It consists of coated fibers that are used to isolate and concentrate analytes into a range of coating materials. After extraction, the fibers are transferred to an analytical instrument for separation and quantification of the target analytes. This is accomplished with the help of a syringe-like handling device that protects your sample while transferring from your sample to the instrument. This syringe-like device also protects your fiber during storage.

More on SPME SPME is also a microextraction technique that, when compared to the sample volume, contains a very small amount of extraction solvent. SPME allows for an equilibrium to be reached between the sample matrix and the extracting phase rather than an exhaustive removal of the analytes to the extracting phase occurring. The extracting phase is permanently attached to a rod that is made out of different materials, which makes this approach practical. The amount of analyte adsorbed by the fiber depends on the thickness of the coating and on the distribution constant of the analyte. Extraction time depends on the length of time required to obtain precise extractions for the analytes with the highest distribution constants. Selectivity can be changed by altering the type of fiber used to match the characteristics of the analytes of interest. Volatile compounds require a thick coating and semivolatile analytes a thin coating.

How does SPME work? First, you draw the fiber into the needle. The needle is then passed through the septum that seals the vial. You then depress the plunger to expose the fiber to your sample or headspace above the sample. Organic analytes are then adsorbed to the coating on the fiber. After adsorption equilibrium is attained, which can be anywhere from 2 minutes to 1.5 hours, the fiber is drawn back into the needle and is withdrawn from the sample vial. Finally, the needle is introduced into the GC injector or SPME/HPLC interface, where adsorbed analytes are thermally desorbed and delivered to the instruments column.

Reaching Equilibrium The extraction is considered to be complete when it reaches equilibrium and the conditions can be described by the following equation: This equation shows the relationship between the analyte concentration in the sample and the amount extracted by the coated fiber. If the amount of analyte extracted onto the fiber is an insignificant portion of that present in the sample, this equation simplifies to n=KfsVfC0 , where the amount of extracted analyte is independent of the volume of the sample. This means that: there is no need to collect a defined amount of sample prior to analysis the fiber can be exposed directly to whatever is being analyzed and the amount of extracted analyte will correspond directly to its concentration in the matrix This allows for the prevention of errors associated with the loss of analyte through decomposition or absorption onto sampling container walls.

Components of a Manual SPME Holder Adjustable needle guide/depth gauge Plunger The O ring Plain Hub Plunger retaining Screw Septum piercing needle Where fiber is exposed in headspace/liquid sample SPME manual holder

Other SPME holders available SPME Portable Field Sampler Contains an internal septum that stores your fiber after sampling by sealing it. Great for field work Comes with a PDMS/Carbowax fiber for trace-level volatile analysis Or a PDMS fiber for concentrating polar analytes This holder is used with an autosampler or an SPME/HPLC interface…requires an upgrade kit for autosampler use. Contains a needle that moves freely for control by an automated system, and for depth regulation in the interface desorption chamber.

SPME fibers available Fiber coating available: Non-bonded Bonded PDMS PDMS/DVB Polyacrylate CAR/PDMS CW/DVB CW/TPR StableFlex DVB/CAR/PDMS Different Phases available: Non-bonded stable w/ some water-miscible organic solvents slight swelling may occur NEVER use nonpolar organic solvents Bonded stable with ALL organic solvents slight swelling possible w/ nonpolar solvents Partially Crosslinked stable in most water-miscible organic solvents May be stable in some nonpolar solvents, but slight swelling possible Highly Crosslinked Equivalent to the partially crosslinked, but some bonding to core has occurred in the past

StableFlex Fibers These type of fibers are coated on a flexible fused silica core instead of the standard fused silica core used on the other fibers. This coating partially bonds to the flexible core which results in: a more stable coating a more durable and longer lasting fiber These special coated fibers are for GC use only . They also have the same temperature, conditioning, and cleaning requirements as the other fiber of its same coating and thickness. These are available in every coating EXCEPT for PDMS, Polyacrylate, and CW/TPR.

Polydimethylsiloxane (PDMS) Film Thickness Description Hub Recommened use 100μm Non-bonded Red/plain Volatiles on GC/HPLC 30μm Yellow/plain Nonpolar semivolatiles on 7μm Bonded Green/plain Moderately polar to nonpolar semivolatiles on

Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene (PDMS/DVB) Film Thickness Description Hub Recommened use 65μm Partially crosslinked Blue/plain Polar volatiles on GC 60μm* Brown/notched General purpose on HPLC StableFlex Fiber Highly crosslinked Pink/plain * This fiber is more durable due to it not containing any epoxy

Polar semivolatiles on Polyacrylate Film Thickness Description Hub Recommened use 85μm Partially crosslinked white/plain Polar semivolatiles on GC/HPLC

Carboxen/Polydimethylsiloxane (CAR/PDMS) Film Thickness Description Hub Recommened use 75μm Partially Crosslinked Black/plain Trace-level volatiles on GC StableFlex Fiber 85μm Highly crosslinked Lt.Blue/plain

Carbowax/Divinylbenzene (CW/DVB) Film Thickness Description Hub Recommened use 65μm Partially crosslinked Orange/plain Polar analytes on GC

Carbowax/Templated Resin (CW/TPR) Film Thickness Description Hub Recommened use 50μm* Partially crosslinked Purple/plain Surfactants on HPLC * This fiber is more durable due to it not containing any epoxy

StableFlex Divinylbenzene/Carboxen/PDMS (DVB/CAR/PDMS) Film Thickness Description Hub Recommened use 50/30μm Highly crosslinked Gray/plain GC Gray/notched

Recommended Temperature and Conditioning for GC Use Maximum Operating Conditioning Time Phase Thickness Temperature Temperature Temperature (Hrs.) PDMS 100μm 280°C 200°C-270°C 250°C 1 30μm 280°C 200°C-270°C 250°C 1 7μm 340°C 220°C-320°C 320°C 2-4 PDMS/DVB 65μm 270°C 200°C-270°C 260°C 0.5 Polyacrylate 85μm 320°C 220°C-310°C 300°C 2 CAR/PDMS 75μm 320°C 240°C-300°C 280°C 0.5 CW/DVB 65μm 265°C 200°C-260°C 250°C 0.5 DVB/CAR/PDMS 50/30μm 270°C 230°C-270°C 270°C 4 Note that the Polyacrylate, or white fiber, will turn brown as a result of condition and will not hurt the performance of the fiber.

Maintenance on SPME Chlorinated solvents my dissolve the epoxy that holds the fiber so DO NOT USE CHLORINATED SOLVENTS EVER. Use caution when handling PDMS/DVB and CW/DVB fibers because the coating can be inadvertently stripped off. Cleaning your fiber depends on the fiber phase coating: Bonded can be taken to maximum temperature and thermally cleaned for 1 hour to overnight, or can be rinsed in an organic solvent and then thermally cleaned. Non-bonded can only be thermally cleaned and can be taken to the maximum temperature for 1 to 2 hours or baked overnight at 10-20 degrees under the maximum temperature. If not clean after this treatment, thermally treat it for 30 minutes at 20 degrees above the maximum temperature. Partially bonded fibers can be rinsed in water-miscible organic solvents.

Sampling with SPME Consistent sampling time, temperature, and fiber immersion depth are crucial to this technique when it comes to high accuracy and precision. Equilibrium is attained more rapidly in headspace than in immersion because the analytes can diffuse more rapidly to the coating on the fiber. The thicker the fiber coating, the more analytes that are extracted, which is proven in the figure below.

Injecting and Running a Sample on GC This is where you inject your SPME needle on the GC-MS

Advantages of SPME During desorbtion of the analyte, the polymeric phase is cleaned and ready for reuse. Absence of solvent makes SPME environmentally friendly separation is faster throughput increases and allows for use of simpler instruments Small in size great for field work. Amount of extracting phase is small and equilibrium of system is not disturbed Very small objects can be studied High sensitivity and limit of determination All extracted analytes are transferred to the analytical instrument Can sample directly into a sample or the headspace above sample. Range of analytes that can be analyzed include volatile, semivolatile, nonvolatile, and inorganic species. coupled with other instruments besides GC like CE, LC, and MS. When compared to similar extraction methods, SPME has a better detection limit, precision, cost, time, solvent use, and simplicity, which is shown in the table below.

Disadvantages of SPME Can get relatively expensive if one is not careful with fibers due to the cost being roughly $108 per fiber. Polymer coating is fragile, easily broken, and have limited lifetime. Also a monopoly with Supelco being the only suppliers of the fibers so cost continuously increases. Its main limitation is its reduced concentration capability due to the small volume of polymer coating on the fiber, which is being addressed and researched further by Dr. Pawliszyn.

Why SPME? It can be used to analyze various types of analytes from gaseous, liquid, and solid samples instead of specializing in just one type like LLE or Headspace. Very cheap compared to other extraction methods. Reduces sample preparation times and disposal costs due to being solvent-free, also a bonus for the environment. Improves detection limits. A very simple methods that almost anyone could perform.

Different fields using SPME Applications SPME is applied to include: Food and drug Environmental Clinical/Forensics

Choosing Best Sample Preparation Technique Sample preparation constitutes for over 80% of your total analysis time so an effective sample is desired, especially by the food and drug industry where time is money. The following is desired in sample preparation of pharmaceuticals: Loss of very little sample Good yield recovery of analyte of interest Coexisting compounds removed efficiently Procedure can be performed conveniently and quickly Cost of analysis is kept to a minimum

Comparing Extraction Methods for Pharmaceutical Analysis SPE and LLE in drug analysis: Both complicated and time-consuming, which limits the number of samples Prone to sample loss due to being multi-step Require large sample amount Require an organic solvent Difficult in automating these procedures Additional cost for waste treatment SPME, as we have heard in previous slides, prevents all of these common drawbacks listed for SPE and LLE.

Similar Microextraction Techniques used for Pharmaceutical Analysis Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) Fiber SPME-main focus of this presentation In-Tube SPME Solid Phase Dynamic Extraction (SPDE)

SBSE Stir bar sorptive extraction, or SBSE, is a very similar technique to SPME. It is a technique that is used for the analysis on both volatile and semivolatile organic compounds in aqueous environmental samples. When compared to SPME, SBSE has higher recoveries and higher sensitivity. The extraction is performed by placing the stir bar in the sample for 30-120 minutes. After extraction, stir bar is placed in a glass thermal desorption tube that is placed in a thermal or liquid desorption unit to be thermally desorbed and analyzed.

In-Tube SPME This technique uses an open tubular capillary as an SPME device. Can be coupled on-line with HPLC or LC/MS which is represented in the provided diagram. In aqueous samples, a direct extraction from sample into coated stationary phase of capillary is performed. These compounds are then desorbed by introducing a stream of mobile phase, or by a static desorption solvent when analytes are more strongly adsorbed to capillary coating. Desorbed compounds are then injected into the LC or HPLC column for analysis. Filtering sample solution before extraction should by performed to prevent plugging of capillary column and flow lines. Extraction yields are generally low, but compounds are reproducible when using an autosampler.

Solid-Phase Dynamic Extraction (SPDE) This technique is for vapor and liquid samples. Dynamic sampling is performed by passing the headspace through the tube using a syringe. They analytes are then concentrated onto PDMS and activated carbon, which are coated onto the inside wall of the needle. This technique permits operation under dynamic conditions while keeping the headspace volume constant. Trapped analytes are then recovered by heat desorption directly into a GC injector body, which was shown to you in a previous slide. A great advantage of this technique over SPME is the robustness of the capillary and the fact that it is nearly impossible to damage this mechanically. This has been used to analyze volatile compounds, pesticides, and some drugs successfully. The only drawback to this technique is that it tends to have carryover because the analytes tend to remain in the inside needle wall after heat desorption.

Environmental Application Air sample Analytes are extracted by the fiber wither by direct exposure or by use of the headspace method. Most applications involve the use of a commercial SPME fiber, but a dialuminum trioxide-coated fiber has been used for VOC sampling. On-site air sampling can be performed by the equilibrium methods or by the non-equalibrium method, with quantification by use of calibration plots from a standard gas generating system of standard gas mixture as opposed to using equations. rapid air sampling can be performed with controlled air-flow rate and quantified by use of diffusion-based calibration methods by use of wither the interface or cross-flow model. Water samples Can be performed by direct immerion (DI), headspace (HS), or in-tube method. The air inside needle must be completely replaced by water and effects of extracted analytes on the external wall of the needle should be avoided. The in-tube SPME has been used for analysis of BTEX, PAH, pesticides, and herbicides in aqueous samples. The fibers have also been used to analyze environmental pollutants in aqueous samples and have been accompanied by ultrasounds or microwaves. Traditional calibration methods have been used for most applications, but diffusion-based calibration methods have been used. Soil and sediment samples Performed by HS or DI methods and applications have been assisted by sonication, microwaves or by heater or cooling fiber. Traditional calibrations but some exhaustive calibration methods have been used in quantification of BTEX in soil samples. A hollow-fiber membrane-protected SPME has also been used for determination of herbicides in sewage-sludge samples.

List of Environmental Applications -gas

List of Environmental Applications-aqueous

List of Environmental Applications-soil/sediment