Viable But Nonculturable State VBNC Viable But Nonculturable State Cetrangolo Elide Conforti Elisa Longobucco Alessandra Matteucci Federica
Vibrio cholerae ed E. coli in acque salate VBNC: microrganismi che entrano in un particolare stato fisiologico in risposta a prolungate condizioni ambientali sfavorevoli, perdendo la capacità di crescere su terreni di routine (coltivabilità) pur restando vitali. Fine anni ‘80 Vibrio cholerae ed E. coli in acque salate
Caratteristiche dello stato VBNC Integrità strutturale della membrana cellulare e del materiale genetico Aumento dello spessore dello strato di peptidoglicano Metabolicamente attive Variazioni morfologiche Aumentata resistenza agli antibiotici Capacità di riacquistare coltivabilità in vivo
Induzione stato VBNC Temperature estreme Carenza di nutrienti Temperature estreme Incubazione al di fuori del range di pH o salinità Stress osmotici Disponibilità di ossigeno Esposizione a metalli pesanti Esposizione a conservanti alimentari Esposizione alla luce bianca e raggi UV Trattamenti battericidi
Regolatori dello stato VBNC RpoS Fattore sigma essenziale per la sopravvivenza delle cellule nella fase stazionaria e per le risposte agli stress In E.coli media l’espressione del 10% del genoma in condizioni di stress. Stress Alarmoni Accumulo RpoS
OxyR Regolatore trascrizionale che controlla i geni correlati allo stress ossidativo. E. coli trattato con H2O2 entra nello stato VBNC. ROS OxyR AhpC e GST
Resuscitation VBNC Resuscitation Microrganismo VBNC Resuscitation Le condizioni per la Resuscitation sono molto specifiche: i fattori che possono condizionare sono il CEPPO, L’ETA’ DELLE CELLULE VBNC, FATTORI DI INDUZIONE DELLO STATO VBNC. Resuscitation window Vibrio cholerae S. Enteritidis Citrobacter freudii
Stimoli uova embrionate, topo, coniglio, umani volontari • Cellule ospiti : amebe, linee cellulari eucariotiche, uova embrionate, topo, coniglio, umani volontari Campylobacter coli, C.jejuni, Edwardsiella tarda, E. faecalis • Rimozione degli stress e presenza di composti specifici ( Disponibilità dei nutrienti) M. luteus •Temperatura E.coli •Stimoli chimici
Rpsf :fattori che promuovono la Resuscitation Possibili meccanismi di azione: Rpsf come molecole segnale secrete attivamente dalle cellule che possono legarsi ai recettori di superficie e attivare la Resuscitation Rpsf degrada o rimodella il peptidoglicano Rpsf permetta il rilascio di frammenti di peptidoglicano i quali legano i recettori di superficie stimolando la Resuscitation Autoinduttori: molecole segnale dotate di cross reattività (E. coli AI-2/3)
Tecniche di rilevamento 1) Colorazioni 2) Metodi Molecolari Live/Dead BacLight -INT IodoNitroTerìtrazolium violet (respirazione) -FITC Isotiocinato di fluorescina (attività enzimatica) 2) Metodi Molecolari -RT-PCR -DNase I footprinting (proteine associate al DNA)
Colorazione Live/Dead Baclight. Cellule vitali verdi Fonte: Invitrogen
Fattori di rischio Presenza di m.o. VBNC in matrici alimentari: potenziali rischi per la salute Alcuni trattamenti a cui sono sottoposti gli alimenti ,al fine di renderli sicuri per il consumo, possono indurre lo stato VBNC. (Legionella pneumophila; Vibrio vullnificus) Alimenti: serbatoio di patogeni umani Fattori di rischio Restano potenzialmente patogeni Maggiore resistenza agli antibiotici (Listeria monocytogenes; Campilobacter jejuni) Minor attivazione del sistema immunitario (minore produzione di TNF-α e IL-6) Tossicità e virulenza residua (L. pneumophila, E.coli)
Alcuni patogeni umani per i quali è stato dimostrato lo stato VBNC Fonte: Laam Li et al.
Saccharomyces cerevisiae Oltre all'importante problematica relativa alla sicurezza alimentare i microrganismi in VBNC rappresentano un problema anche in relazione alla shelf -life ed alla stabilità microbiologica degli alimenti e delle bevande. Alcuni microrganismi presenti nel vino, possono entrare nello stato VBNC in seguito all’esposizione alla solforosa o alla scarsa presenza di ossigeno. Saccharomyces cerevisiae Dekkera bruxellensis Batteri acetici
Grazie per l’attenzione