Giacomo Monticelli Università degli studi del Piemonte Orientale «A.Avogadro» Laboratorio di Biologia Molecolare Dipartimento di Scienze della Salute – Novara Caratterizzazione del ruolo di USP10 all’interno della risposta al danno al DNA

Introduzione Le cellule vengono continuamente esposte ad una moltitudine di lesioni a livello del DNA; per combattere le minacce e riparare il proprio materiale genetico, esse hanno sviluppato un complesso meccanismo di sorveglianza chiamato Risposta al Danno al DNA (DDR – DNA Damage Response). RNF168 è una proteina nucleare che, grazie ai suoi domini che legano l’ubiquitina è in grado di riconoscere l’ubiquitina stessa ed essere in questo modo reclutata ai foci di danno, in cui ubiquitina gli istoni H2A ed H2A.X. Inizialmente l’ubiquitinazione fu caratterizzata come processo di marcatura per l’indirizzamento delle proteine verso la degradazione proteolitica. Più recentemente, invece, è emerso un ruolo di tipo non degradativo a carico di questa modificazione post-traduzionale. L’aggiunta, da parte di ubiquitin-ligasi, di monomeri di ubiquitina sulla lisina 63 (K63), della prima ubiquitina aggiunta al substrato, è largamente associato con la riparazione del danno al DNA. Il laboratorio in cui ho svolto la mia tesi è focalizzato sulla caratterizzazione di RNF168 all’interno del DDR. Grazie ad una analisi di spettrometria di massa, sono stati individuati diversi interattori tra cui USP10. USP10 è una deubiquitinasi (DUB) capace di indurre la stabilizzazione di p53. Il mio lavoro di tesi ha contribuito a caratterizzare il ruolo di USP10 nella risposta al danno al DNA.

Descrizione del protocollo e Risultati ottenuti Preparazione degli inserti USP10full-length USP10(1-100) USP10(101-412) USP10(412-798) Denaturazione iniziale 94°C 4 min Denaturazione 94°C 30 sec Appaiamento 40°C 30 sec 6 cicli Estensione 72°C 2 min Appaiamento 50°C 30 sec 24 cicli Estensione finale 72°C 7 min Denaturazione iniziale 98°C 30 sec Denaturazione 98°C 10 sec Appaiamento 48°C 20 sec 4 cicli Estensione 72°C 8 sec Appaiamento 60°C 20 sec 21 cicli Estensione finale 72°C 7 min Denaturazione iniziale 98°C 30 sec Denaturazione 98°C 10 sec Appaiamento 50°C 20 sec 4 cicli Estensione 72°C 17 sec Appaiamento 60°C 20 sec 21 cicli Estensione finale 72°C 7 min PCR 1 798 1 100 101 412 412 798 For Rev For Rev For Rev For Rev

Scelta del Vettore di Espressione Digestione enzimatica del Vettore pGEX-6P-1 è un plasmide avente: Una sequenza capace di conferire resistenza all’antibiotico Ampicillina Un Multi Cloning Site (MCS) contenente diversi siti di taglio per enzimi di restrizione La sequenza codificante per la Glutatione Sefarosio-Transferasi (GST), che permetterà alla proteina codificata di possedere un Tag GST in grado di isolarla e riconoscerla all’interno di un «pool» proteico Una sequenza, presente nel MCS, riconosciuta dalla Proteasi PreScission che può rimuovere il Tag GST, tramite taglio enzimatico, dalla proteina di interesse

Digestione enzimatica degli inserti Corsia 1 USP10full-length digerito da BglII ed XhoI. Altezza della banda attesa a 2397 pb. Corsia 1 USP10(1-100) digerito da BglII ed XhoI. Altezza della banda attesa a ~300 pb. Corsia 1 USP10(101-412) digerito da BglII ed XhoI. Altezza della banda attesa a ~933 pb. Corsia 2 USP10(412-798) digerito da BglII ed XhoI. Altezza della banda attesa a ~1158 pb. Per poter ottenere estremità complementari, che permettano l’inserimento delle sequenze di interesse all’interno del vettore di espressione, è necessario utilizzare gli stessi enzimi di restrizione. Essendo USP10 sensibile al taglio di BamHI ma non a quello di BglII, essendo BglII isocaudamero di BamHI ed essendo presente solo la sequenza tagliata da quest’ultimo nel MCS del vettore di espressione, abbiamo scelto questa tattica di clonaggio.

Defosforilazione del vettore di espressione Reazione di clonaggio e trasformazione dei batteri competenti Purificazione e quantificazione di pGEX-6P-1 e degli inserti Attraverso la defosforilazione è possibile limitare l’eventualità che il vettore si possa richiudere su se stesso senza incorporare l’inserto. La defosforilazione è ad opera dell’enzima CIP, una fosfatasi alcalina che stacca il fosfato dalle basi delle estremità tagliate. Il vettore e gli inserti sono stati purificati attraverso appositi kit per eliminare interferenti che potrebbero falsare il risultato e quantificati mediante l’utilizzo di uno spettrofluorimentro (Qubit) per conoscere la concentrazione effettiva di cloni ottenuti. Processo di ligazione: V:I V:I USP10(full-length) 1:1 1:2 USP10(1-100) 1:4 1:8 USP10(101-412) 1:2 1:4 USP10(412-798) 1:1 1:2 Una volta terminata la reazione, abbiamo proceduto con la trasformazione dei costrutti nei batteri competenti JM109; un ceppo Escherichia coli caratterizzato da una buona efficienza di trasformazione. Infine, usando un’ansa sterile, ho piastrato i batteri trasformati su piastre di LB agar contenente Ampicillina e li ho fatti crescere in agitazione a 37°C per tutta la notte.

Screening delle colonie ottenute Fig.1 Screening delle colonie ottenute Al fine di capire la bontà del prodotto di ligazione, viene eseguita una PCR di screening: i due primer utilizzati sono posti uno sul vettore ed uno sull’inserto. Risultato dell’amplificazione: Fig.1 USP10 full-length E’ stata ottenuta una banda in due corsie diverse, quindi abbiamo due cloni positivi: #9 e #18 Fig.2 USP10 (1-100) USP10 (101-412) i primi 3 amplificati Per USP10 (1-100) sono stati selezionati i cloni #9 e #12 Fig.3 USP10 (101-412) dal #4 al #16 USP10 (412-798) i primi 6 amplificati Per USP10 (101-412) sono stati selezionati i cloni #13 e #16 Per USP10 (412-798) è stato selezionato il clone #1 Fig.4 USP10 (412-798) Per USP10 (412-798) è stato selezionato il clone #15 Fig.2 Fig.3 Fig.4

Digestioni di controllo Pur avendo già avuto conferma della bontà della ligazione vettore-inserto dalla PCR di screening, abbiamo ulteriormente confermato la bontà del clonaggio tramite digestione di controllo. La digestione enzimatica di USP10 full-length, rappresentata schematicamente nella slide, è poi stata eseguita anche per le sequenze inserto USP10 (101-412) e USP10 (412-798) avendo cura di selezionare enzimi in grado di tagliare rispettivamente nella sequenza inserto e nel vettore, in particolare: USP10 (101-412) Kpn I sull’inserto EcoRV sul vettore USP10 (412-798) EcoRV su vettore ed inserto Non avendo ottenuto un risultato esaustivo dallo screening per USP10 (1-100) abbiamo effettuato l’analisi di controllo tramite l’utilizzo della PCR. USP10 full-length USP10 full-length digerito con Sal I (taglio nell’inserto) e Not I (taglio nel vettore)

Conclusioni Con l’obiettivo di caratterizzare il ruolo di USP10 all’interno della risposta al danno al DNA abbiamo effettuato una serie di clonaggi volti all’ottenimento di sequenze da impiegare in studi in vitro. Lo scopo degli esperimenti in vitro è quello dell’individuazione e mappatura di possibili UBD (Ubiquitin Binding Domain) all’interno della sequenza di USP10. L’identificazione di tali domini permetterebbe una migliore comprensione, della capacità funzionale della DUB nella riparazione del DNA.

Grazie per l’attenzione!