Scelta dei metodi analitici e loro validazione Requisiti ISO 17025: i metodi utilizzati in laboratorio devono essere validati Validazione: conferma, sostenuta attraverso evidenze oggettive, che i requisiti relativi ad una specifica utilizzazione o applicazione prevista siano stati soddisfatti

Metodi analitici normati: emessi da enti nazionali ed internazionali che oltre ad occuparsi dello sviluppo del metodo effettuano anche la validazione e inseriscono alcuni parametri prestazionali

Metodi analitici non normalizzati: metodi interni sviluppati direttamente dal laboratorio o da enti non ufficiali o non riconosciuti a livello internazionale

Scopo e finalità delle analisi devono essere ben note come premessa alla scelta di un metodo, in particolare quando devono essere espressi giudizi a fronte di limiti di legge

Decreto Legislativo 2 febbraio 2001, n. 31 "Attuazione della direttiva 98/83/CE relativa alla qualita' delle acque destinate al consumo umano" pubblicato nella Gazzetta Ufficiale n. 52 del 3 marzo 2001 - Supplemento Ordinario n. 41 Antimonio 5,0 µg/l Arsenico 10 µg/l Boro 1,0 µg/l Bromato 10 µg/l Cadmio 5,0 µg/l Cromo 50 µg/l Rame 10 mg/l Per poter dare un effettivo giudizio di conformità dovrò utilizzare metodi con un limite di rilevabilità almeno pari a 1/10 del limite di legge

Le tecniche analitiche pertanto dovranno essere scelte in base allo scopo dell’analisi, non sempre adottando semplicemente la tecnica più recente o più sensibile

Informazioni minime che un metodo deve contenere Modalità operative Nome del soggetto che lo emette Matrice/i su cui il metodo è applicabile Limite di quantificazione e rilevabilità Attrezzature e CRM richiesti (ove applicabile) Informazioni sulla sicurezza Livello di qualità di standard e reagenti

Requisiti impliciti che il laboratorio vuole trovare nei metodi Precisione Accuratezza Rapidità di esecuzione Basso costo

Parametri di validazione: limite di rilevabilità Il limite di rilevabilità (LOD) è la più bassa concentrazione di un analita che può essere rilevata all'interno di un campione mediante confronto con il relativo bianco ad un dato grado di rischio. Occorre analizzare una matrice debolmente fortificata valutando il livello di concentrazione che ci permette di stabilire la presenza/assenza dell’analita con un livello fiduciale del 95%

Parametri di validazione: limite di quantificazione Valore minimo di concentrazione dell’analita a cui risulta ancora possibile eseguire il metodo analitico mantenendo invariati i requisiti prestazionali (es. ripetibilità) Di solito equivale a 10 volte la deviazione standard di un bianco o di una matrice debolmente fortificata

Parametri di validazione: linearità La linearità di un metodo viene valutata come la presenza di una relazione lineare tra il segnale misurato e la concentrazione dell’analita: pur essendo indispensabile per determinare il campo di misura del metodo non è scontato che le due cose coincidano La stima della linearità viene eseguita attraverso la stima della correlazione (r), la costruzione di una curva di interpolazione (retta di regressione), verifica della corretta interpolazione (R2)

Precisione e accuratezza

Precisione La precisione è connessa all’errore indeterminato e rappresenta la vicinanza o dispersione dei risultati ottenuti per uno stesso campione. La precisione è rappresentata dalla deviazione standard dei risultati o dalla stima della medesima. Essa è valutata attraverso l’esecuzione di analisi replicate. Si distingue inoltre tra: - ripetibilità: grado di accordo tra le misure nella stessa matrice ottenute con lo stesso metodo dallo stesso analista nello stesso laboratorio in un tempo ragionevolmente breve; - riproducibilità: grado di accordo tra misure della stessa grandezza nella stessa matrice, ottenute con lo stesso metodo in laboratori diversi.

Accuratezza L’accuratezza Nella letteratura chimica il termine “accuratezza” è inteso con due accezioni diverse. Secondo la prima accezione, l’accuratezza rappresenta la differenza (errore o scarto) tra il valore della media dei risultati e il valore vero o ritenuto tale della quantità misurata. L’accuratezza è una misura dell’errore sistematico di una misura ed è legata a due fattori: il metodo di analisi e le modalità di utilizzo del metodo stesso nel laboratorio. L’accuratezza di un metodo di analisi può essere valutata con prove interlaboratorio e quella delle sue modalità di utilizzo con tecniche di controllo di qualità. Secondo altri autori, soprattutto americani, l’accuratezza è la vicinanza tra il valore osservato ed il valore vero, o comunque accettato come tale, e deriva dalla combinazione di una componente casuale (errori casuali, che determinano precisione) e di una componente sistematica (errori sistematici, in inglese bias).

Rappresentatività Un metodo di analisi può esser molto accurato, ma i risultati non sono utilizzabili se non riflettono la composizione del campione o se il campione non rappresenta la popolazione (ad esempio la zona di suolo) da cui è stato prelevato. Spesso il campionamento è lo stadio più critico nell’intero processo analitico ed è lo stadio che limita l’accuratezza dell’analisi. Questo è particolarmente vero quando il campione da analizzare sia un sistema di grandi dimensioni e non omogeneo, come ad esempio un lago, un suolo, un pezzo di tessuto animale. Il prodotto finale dello stadio di campionamento è costituito da pochi grammi o chilogrammi e può costituire una parte rispetto a 107 o 108 del materiale di partenza. Comunque il campione deve avere, nei limiti del possibile, una composizione identica alla composizione media della massa totale.

Sensibilità La sensibilità di un metodo è data dal rapporto   Dove Dy è la variazione della risposta per una variazione di concentrazione DC. Essa rappresenta quindi il segnale misurato per una concentrazione unitaria. La sensibilità corrisponde alla pendenza della curva di calibrazione

Specificità La selettività di un metodo di analisi indica in che misura la determinazione di un elemento è affetta da interferenze da parte di altri analiti o componenti della matrice. Un metodo completamente selettivo è in grado di determinare l’analita senza interferenze e viene detto specifico.

Recupero Le tecniche analitiche non consentono sempre la determinazione totale dell’analita di interesse: occorre verificare a più livelli di concentrazione il quantitativo perduto su matrici opportunamente fortificate o materiali di riferimento certificati

Robustezza Un metodo viene definito robusto se la qualità dei risultati è indipendente da piccole variazioni nell’esecuzione della procedura. A titolo di esempio, un metodo robusto è insensibile ad una aumento della temperatura di riscaldamento da 95 a 100°C, oppure ad un aumento di concentrazione di acido da 1,0 a 1,1 M, o infine ad una diminuzione di pH da 5,0 a 4,7.

Robustezza Occorre quindi esaminare ogni singola fase del metodo analitico, decidere quali possono influenzare il risultato in modo sensibile ed introdurre appositamente delle variazioni, valutandone gli effetti

Esempio 1: metodo normato Determinazione dei metalli in acqua potabile con tecnica ICP OES APAT CNR IRSA 3020 Man 29 2003

In questo caso tutte le informazioni sono già contenute nel metodo analitico, il laboratorio deve solo verificare di essere in grado di rispettarne le caratteristiche prestazionali (ripetibilità, condizioni strumentali, ecc.) ISO 17025 e ACCREDIA stabiliscono, con apposito requisito, che qualora il metodo normato non fosse sufficientemente dettagliato occorre valutare ed inserire le informazioni mancanti in un documento chiamato procedura di prova. La procedura di prova è anche uno strumento utile per definire gli accorgimenti o le modifiche di piccola entità effettuate dal laboratorio sul metodo, purché non richiedano validazione

Esempio 2: metodo sviluppato dal laboratorio Grassi su cereali e derivati, metodo per idrolisi acida Campione macinato e sottoposto ad idrolisi acida Determinazione gravimetrica del residuo Estrazione soxlet

In questo caso è il laboratorio che deve valutare ogni singolo aspetto di quelli discussi in precedenza, con particolare riguardo alla robustezza del metodo

La completa validazione potrà però essere raggiunta solo: Eseguendo le prove su un CRM Valutando lo stesso parametro con un metodo normato Partecipando ad un circuito interlaboratorio

Per tutti i metodi, normati e non, deve comunque essere valutata l’incertezza di misura